發布時間：2021-05-18所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)是一種革蘭氏陰性致病菌，引發水產動物以及人類的多種疾病，對水產養殖業以及人類公共健康造成嚴重威脅，但其致病機制尚不明確。維氏氣單胞菌C4菌株基因組分析發現，與細菌Ⅲ型分泌系統有關的鞭毛合成基因fliE相鄰位置存
摘要維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)是一種革蘭氏陰性致病菌，引發水產動物以及人類的多種疾病，對水產養殖業以及人類公共健康造成嚴重威脅，但其致病機制尚不明確。維氏氣單胞菌C4菌株基因組分析發現，與細菌Ⅲ型分泌系統有關的鞭毛合成基因fliE相鄰位置存在一個功能未知的AraC家族轉錄因子編碼基因，我們將其命名為asfR。NCBICD-Search預測結果顯示AsfR蛋白含有一個保守的HTHDNA結合功能域，以及一個類似GyrI的小分子結合功能域。已知AraC蛋白超家族廣泛存在于細菌中，參與從碳代謝、應激反應，到細菌毒力和致病性的多種生命活動的調節。asfR基因在維氏氣單胞菌AVNIH1和TH0426菌株中高度保守，但對其生物學功能的研究尚未見報道。為進一步探究該蛋白的功能，本研究采用同源重組手段構建asfR基因敲除菌株，并與野生型菌株進行初步比較，發現asfR基因敲除不影響致病菌在富營養條件下的生長能力，但能顯著提高其在逆境下的生長能力，而且其生物膜形成能力減弱。上述結果表明，AsfR參與維氏氣單胞菌生物膜形成以及逆境抵抗。本研究為進一步鑒定該蛋白的生物學功能提供了必要的研究工具和初步的理論基礎。
關鍵詞維氏氣單胞菌,asfR,基因敲除,生長,生物膜
維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)是一類造成嚴重危害的革蘭氏陰性致病菌，引起魚體爛尾病、敗血癥等(Malliketal.,2020;Ranetal.,2018)，還能引發人類腹瀉、腦膜炎、壞死性筋膜炎等疾病(Predigeretal.,2020;Parrasetal.,1993;Cuietal.,2007)。維氏氣單胞菌能分泌多種與其致病性密切相關的胞外產物，包括氣溶素、溶血素、腸毒素、蛋白酶等(Huetal.,2012;Ranetal.,2018)。已知細菌Ⅲ型分泌系統T3SS是革蘭氏陰性致病菌的關鍵毒力因子，其發揮分子注射器的功能，將大量效應物注射到宿主細胞的胞漿中，進而影響宿主的細胞代謝通路(GalánandWolf-Watz,2006)。新近研究表明，細菌的鞭毛活性，通過影響其在感染部位的運動能力，進而間接調控Ⅲ型分泌系統功能(Hirakawaetal.,2020)。另外，在面臨宿主以及自然環境中的惡劣條件時，致病菌通常以形成生物膜的方式提高種群生存率,包裹在生物膜內的細菌細胞對宿主體內的免疫細胞、抗體和抗生素等具有抵抗力，使得宿主防御系統和抗菌藥物無法清除生物膜內的細菌病原體(Royetal.,2018,Diasetal.,2018)。深入探究A.veronii的致病機制，將為預防與治療該致病菌導致的動物和人類疾病、減輕其所造成的經濟損失提供理論依據。
我們前期對維氏氣單胞菌C4的基因組數據進行分析發現，在與Ⅲ型分泌系統有關的鞭毛合成基因fliE的相鄰位置處，存在一個功能未知的基因，其被注釋為AraC超家族轉錄調控因子(AraCfamilytranscriptionalregulator)編碼基因，我們將其命名為asfR(AraCSuperfamilyregulator)。通過NCBI比對發現，該基因在維氏氣單胞菌的強毒株系AVNIH1和TH0426中高度保守，同源性達98%。NCBICD-Search預測結果顯示，AsfR蛋白含有一個保守的AraC家族HTHDNA結合功能域，以及一個類似GyrI的小分子結合功能域。已知AraC轉錄因子蛋白超家族廣泛參與革蘭氏陽性和陰性細菌的碳代謝、應激反應、毒力以及耐藥性等多種生命進程(Yangetal.,2011;Pletzeretal.,2014;Santiagoetal.,2016;Gallegosetal.,1997)。在結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)中，一個假定AraC家族轉錄因子基因鄰近膽固醇降解相關的芳胺N-乙酰基轉移酶(nat)基因，其被鑒定能激活nat基因簇(Evangelopoulosetal.,2014)。為了探明AsfR的生物學功能，本研究采用同源重組基因敲除技術，構建了asfR基因敲除菌株，并與維氏氣單胞菌野生型進行比較，初步測定敲除株的生長能力和生物膜形成能力。本研究的結果為進一步研究AsfR蛋白在維氏氣單胞菌致病性調控方面的功能提供了必要的研究工具，并奠定了初步的研究基礎。
1結果與分析
1.1基因敲除載體的構建
以A.veroniiC4的基因組為模板，設計特異性引物(表1)分別擴增asfR基因上下游同源臂，基于同源重組原理對A.veroniiC4asfR基因進行敲除(圖1)。擴增結果如圖2所示，參照DNAMarker條帶大小，asfR上/下游同源臂片段分別為500bp和750bp左右，與實際asfR上/下游同源臂片段大小536bp和705bp相符。采用重疊延伸PCR技術(genesplicingbyoverlapextensionPCR)連接asfR上下游同源臂，獲得融合產物1300bp左右(圖2)。PCR產物條帶單一、無污染，符合后續實驗要求。
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采用無縫克隆技術連接asfR同源臂和pRE112質粒(圖3)。將pRE112質粒酶切后，與asfR同源臂按摩爾比1:2的體系混合，在重組酶的作用下于50℃連接5分鐘。將連接產物以電擊轉化的方式導入至E.coliWM3064中，并涂布于含有50μg/mLDAP(二氨基庚二酸)和25μg/mLCam(氯霉素)的LB板上進行篩選，其中，DAP為E.coliWM3064的必需營養物質，Cam用于篩選陽性轉化子。隨后，通過pRE112載體特異性引物以及目的基因驗證引物(表1)驗證陽性轉化子。圖4顯示通過pRE112載體特異性引物驗證的結果，泳道2陽性對照的模板為pRE112質粒，擴增條帶大小約600bp;泳道5、7、8、9以轉化子菌液為模板，獲得PCR產物為1900bp左右，與理論值相符。泳道3的轉化子產物大小有偏差，泳道6的轉化子產生兩條產物帶，因而將其舍棄。圖5顯示進一步通過目的基因驗證引物驗證的結果，泳道2的陽性對照為以A.veroniiC4基因組為模板進行擴增的PCR產物，條帶大小為2000bp左右;泳道5、7、8、9以轉化子菌液為模板，獲得PCR產物為1500bp左右，與理論值相符。將檢測的陽性轉化子進行測序，測序結果比對分析進一步證實asfR基因敲除載體pRE112-ΔasfR構建成功。
1.2細菌接合
通過細菌接合的方式將E.coliW3064菌中的asfR敲除載體pRE112-ΔasfR轉移至維氏氣單胞菌C4中，通過25μg/mLCam和50μg/mLAmp的雙抗平板篩選獲得敲除載體的受體克隆子。采用pRE112載體特異引物，通過菌落PCR驗證陽性克隆子。驗證結果如圖6所示，泳道2-9中的PCR產物條帶大約為1900bp左右，與理論結果相符，表明pRE112-ΔasfR載體已經成功轉移至A.veroniiC4中(圖6)。
1.3蔗糖板篩選asfR基因敲除菌株
挑取平板單菌落，將含有pRE112-ΔasfR載體的維氏氣單胞菌C4于LB中過夜培養后，然后涂布于含有8%蔗糖的平板上進行篩選，菌落PCR驗證陽性克隆子。以A.veroniiC4野生型基因組為模板所擴增的PCR產物為陽性對照。驗證結果如圖7所示，結果表明ΔasfR敲除株中擴增的條帶大小約1500bp(泳道4-16)，而野生型陽性對照中擴增的條帶大小約2000bp(泳道1)，表明重組菌株中目的基因asfR敲除成功。將PCR產物測序，結果顯示ΔasfR的測序結果與WT中asfR基因編碼區域存在序列不一致的情況，而與asfR基因上下游同源臂序列完全一致，結果進一步證實維氏氣單胞菌C4asfR基因敲除菌株ΔasfR已構建成功(圖8)。
1.4asfR敲除對維氏氣單胞菌生長的影響
為了分析asfR基因敲除后對菌株生長的影響，我們分別在富營養(LB培養基)和寡營養(M9培養基)條件下比較維氏氣單胞菌C4野生型(WT)和ΔasfR的生長情況。結果顯示，在富營養條件下，WT和ΔasfR的生長能力無明顯差異(圖9);但在寡營養條件下培養大約5h時，ΔasfR菌株的生長速度開始超過WT菌株，在培養至大約35h時，兩者的生長差異達到最大(圖10)。該研究結果表明，asfR基因敲除能夠增強維氏氣單胞菌在營養匱乏的逆境條件下的生長能力。
1.5asfR基因敲除對生物膜形成的影響
采用結晶紫染色方法，探究asfR基因敲除對菌株生物膜形成的影響。將WT和ΔasfR菌株分別定量培養于96微孔板中，培養36h后，將96孔板中的培養液分別吸出，用無菌PBS沖洗，隨后經0.5%結晶紫染色、無菌水沖洗、33%醋酸溶解等步驟后，測量吸光度值。結果顯示，與WT相比，ΔasfR的生物膜形成能力顯著較弱，二者之間具有極顯著性差異(P<0.01)(圖11)。結果表明AsfR對A.veroniiC4的生物膜形成能力具有促進作用。
2討論
本研究基于同源重組原理，通過自殺質粒與C4基因組兩次同源重組，對目的基因asfR進行敲除�；谕粗亟M原理進行的基因敲除，是目前研究生物體內基因功能的一種重要且廣泛使用的方法，操作對象不限于細菌(Swingleetal.,2010)，古菌(王小利等，2015)，還包括真菌(SymingtonandGautier,2011)，植物(Reiss,2003)，動物(Lanetal.,2016)等真核生物。同源重組技術通常將目的基因的上、下游同源臂分別通過PCR擴增獲得，經限制性內切酶酶解，然后由DNA連接酶連接至自殺質粒中(Celieetal.,2016)。該種方法需要保證DNA片段和質粒同時具有所適用的限制性內切酶酶切位點，而且有時需要進行分步酶切，這增加了實驗操作的復雜度，并會損耗實驗樣品量(Shaoetal.,2009)。本研究在連接自殺質粒之前，采用重疊延伸PCR技術連接asfR上/下同源臂，有利于降低多片段與載體連接的難度，并提高重組載體構建成功率(Raymondetal.,1999;DahmandJennewein,2010)。隨后，本研究采用無縫克隆技術連接片段和載體。無縫克隆技術無需對目的基因片段進行酶切，消除了限制性內切酶的限制，簡化了操作步驟(Birdetal.,2014)。
生物膜是與致病菌毒力相關的另一重要因素，生物膜的形成使得致病菌能夠耐受惡劣的生存環境，并對抗菌治療以及宿主的免疫系統產生抵抗力，從而導致多種慢性疾病(Royetal.,2018)。群體感應特性、胞外多糖(EPS)，以及由細菌鞭毛介導的游泳和群集運動等都是決定生物膜形成的重要原因(Packiavathyetal.,2014)。本研究發現，asfR基因敲除株與維氏氣單胞菌野生型相比，其在富營養條件下的生長能力沒有差別，但逆境環境下的生長能力提高，而且其生物膜形成能力減弱。在維氏氣單胞菌胞外分泌產物的調控研究中報道了類似的現象，編碼胞外分泌產物組分的hisJ基因被敲除后，敲除株與野生型相比在富營養條件下的生長能力無顯著差異，但生物膜形成能力下降，并且毒力也下降達865倍(Zhangetal.,2020)。由于asfR基因與Ⅲ型分泌系統相關的鞭毛合成基因fliE相鄰，我們預測AsfR可能通過轉錄調控鞭毛合成基因fliE，進而對三型分泌系統，以及細菌毒力產生影響。本研究初步鑒定了未知蛋白AsfR的生物學功能，為研究維氏氣單胞菌的致病機制提供了一定的理論基礎。
3材料與方法
3.1實驗材料
自殺型質粒pRE112、E.coliWM3064均為實驗室所儲存;實驗所涉及引物以及樣品測序由上海生工提供服務。本研究涉及的引物如表1所示。實驗所用試劑盒以及其他實驗試劑如表2所示。
3.2asfR基因上下游同源臂片段的擴增
以維氏氣單胞菌基因組為模板，采用引物對asfRF1/R1擴增目的基因asfR的上游同源臂片段，引物對asfRF2/R2擴增下游同源臂片段。PCR加樣體系(50μL)為：基因組DNA2μL(30ng/μL)，2×PCRMix25μL，上/下游引物各2μL，ddH2O19μL。PCR擴增程序為:95℃10min，95℃30S，56℃30S，72℃1min30S，30cycles，72℃10min。使用PCR產物純化試劑盒將PCR擴增獲得的asfR基因上下游同源臂片段進行純化回收，于-20℃保存。
3.3重疊延伸PCR技術連接asfR基因上下游同源臂片段
以asfR基因上下游同源臂的重疊部分互補配對，進行退火，延伸15個循環。PCR加樣體系(50μL)為：asfR基因上/下游同源臂DNA各2μL，2×PCRMix25μL，ddH2O21μL。PCR擴增程序為:95℃10min，95℃30S，56℃30S，72℃1min30S，15cycles，72℃10min。在上述反應體系中加入引物對asfRF1/R2各1μL，繼續20個循環的PCR擴增，使用PCR產物純化試劑盒進行回收及純化。
3.4pRE112-ΔasfR載體構建
使用KpnI和SacI酶切pRE112質粒。將酶切后的質粒與融合的asfR同源臂按下列連接反應體系(10μL)混合：4μLpRE112酶切產物(31ng/μL)，1μLasfR同源臂酶切產物(50ng/μL)，5μL2×ClonExpressMix。將連接產物于50℃連接5min，電擊轉化至E.coliWM3064感受態細胞中。將電轉后的感受態細胞涂布于含有25μg/mLCam的抗性平板上，在37℃下倒置培養。菌落PCR驗證陽性克隆子。
3.5細菌接合
將維氏氣單胞菌C4和攜帶pRE112-ΔasfR載體的E.coliWM3064分別于含25μg/mLCam和50μg/mLAmp的LB培養基中過夜培養。按0.02OD/mL轉接，并培養至OD值為0.4-0.6，將維氏氣單胞菌C4和E.coliWM3064按1:1，2:1，1:2的比例混合至終體積為800μL。6000rpm離心3min后棄上清，重懸菌體。取50μL滴于含有50μg/mLDAP的LB培養平板上，30℃倒置培養24h。刮取平板上的菌落，涂布于含有25μg/mLCam和50μg/mLAmp的雙抗平板上，菌落PCR驗證接合子。
3.6蔗糖板篩選
挑取成功接合的單菌落，接種到LB培養基中，30℃過夜搖菌。取100μL菌液，涂布于8%蔗糖板上。于30℃下倒置培養24h。菌落PCR驗證asfR敲除菌株，隨后送往上海生工測序。——論文作者：�；勖赳R香*李宏唐燕瓊王丹唐鴻倩劉柱
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