發布時間：2022-03-21所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要：生物反應器大規模培養技術在生物制劑領域和醫學領域發揮著至關重要的作用，生物反應器大規模培養動物細胞的方法有微載體培養、片狀載體培養和全懸浮培養等，與傳統的動物細胞大規模培養工藝相比有明顯的技術優勢。本文主要分析了動物細胞生物反應器大規模培養技
摘 要：生物反應器大規模培養技術在生物制劑領域和醫學領域發揮著至關重要的作用，生物反應器大規模培養動物細胞的方法有微載體培養、片狀載體培養和全懸浮培養等，與傳統的動物細胞大規模培養工藝相比有明顯的技術優勢。本文主要分析了動物細胞生物反應器大規模培養技術的研究進展，以供參考。
關鍵詞：生物反應器;微載體;片狀載體;全懸浮培養
動 物 細 胞 的 大 規 模 培 養(large-scale culture)是通過使用生物反應器在精確控制溫度、溶氧、pH 等條件下實現的 [1]，該技術在生物制劑的生產中發揮著重要作用。動物細胞大規模培養生產的產品包括蛋白質藥物、單克隆抗體、病毒疫苗等。近幾十年來，動物細胞生物反應器大規模培養技術有了很大的發展，在傳統的生物反應器的設計上做了很多重要的改進，并且開發了多種新型的生物反應器，例如：多功能膜生物反應器、Couette-Taylor 生物反應器等。生物反應器所需達到的兩個最主要的目標，一是通過高密度培養動物細胞增加產量，生產高價值的蛋白質藥劑或臨床病毒載體 ;二是創造一個類似于體內環境的三維空間來增殖傳統培養系統中難以培養的有價值細胞。動物細胞生物反應器大規模培養常用的方法有微載體培養、片狀載體培養和全懸浮培養，其技術的主要進展情況綜述如下。
1 微載體培養
微載體培養是融合懸浮培養優點的一種特殊的細胞貼壁培養模式。細胞微載體培養的基本特征是細胞貼附于微載體的表面并隨微載體懸浮于細胞培養液中。隨著生產需求的增長，微載體培養細胞很容易放大，多孔微載體是一種新型的微載體，細胞可以生長在其表面和內部，這在很大程度上增大了細胞的生長面積。適合微載體大規模培養的細胞有 Vero、BHK21、 MDCK、Marc-145、PK15等。
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以交聯葡聚糖為基質材料的實體微載體- Cytodex-1和 Cytodex-3是 Vero 細胞培養中使用最多的微載體。Cytodex-3是由變性膠原包被交聯葡聚糖基質構成的，1 g Cytodex-3提供的表面積約為 2 700 cm2 ，細胞總量可達 4.6×108 個，且對細胞具有良好的相容性。Cytodex-1交聯葡聚糖為基質時，表面包裹有帶正電荷的 N，N二乙基氨基乙基(DEAE)基團使細胞更適合于細胞貼附生長。1 g Cytodex-1細胞生長面積約為 4 400 cm2 ，細胞總量可達 6×108 個。1967年出現了微載體細胞培養，20世紀 80年代巴斯德研究所用1 000 L 規模的生物反應器微載體培養 Vero 細胞生產脊髓灰質炎疫苗和人用狂犬病疫苗，目前巴斯德研究用微載體培養的 Vero 細胞在攪拌式生物反應器中生產流感疫苗，其細胞培養工藝在8個周內就可以將復蘇的細胞放大到 6 000 L 的規模 [2]。攪拌式生物反應器通過灌注培養技術利用微載體或多空載體細胞密度最終可以達 107 個 /ml 以上。
2 片狀載體培養
片狀載體是無紡聚酯纖維片，屬于一種細胞貼壁載體，具有很大的比表面積 (1 200 cm2 .g-1)，可以多次使用。自 20世紀 90年代中期美國的 NBS 公司推出片狀載體 (FibraCel) 和固定藍式攪拌系統以來，相關的產品設備已廣泛應用于基因藥物治療、病毒性疫苗和細胞分泌物等生物制品及醫藥產業的實際生產中。
固定床式生物反應器用片狀載體大規模培養 293T 細胞增殖慢病毒的工藝中，在1.5 L 反應器中加入 50 g 片狀載體，按 8.0×105 個 /mL 接種，當細胞培養3 d 時，細胞密度達1×107 ～ 1.5×107 個 /mL[3]。用14 L 籃式生物反應器培養 Vero 細胞生產人用狂犬病疫苗時(片狀載體500 g)，按10 L 培養液接種5.0×109 個 Vero 細胞，灌流培養使培養液中葡萄糖含量保持在1.0 g/L 以上，直至細胞生長進入平臺期，葡萄糖消耗量為240 ～ 420 g，細胞接種96 h 后達對數生長期，根據消耗的葡萄糖量計算細胞總數 , 培養156 h 后細胞密度可達 1.0×107 個 /ml[4]。
3 全懸浮培養
細胞懸浮培養是利用生物反應器大規模培養動物細胞生產生物制品的核心技術，是目前國際上生物制品生產的主流模式。動物疫苗生產的核心環節就是病毒抗原的生產制造，傳統的轉瓶或雞胚工藝生產效率低、勞動強度大、批間差異大，這些先天的缺點導致產品質量差，成本居高不下，已經不能滿足規�；B殖客戶的需求。生物反應器以其規模大、生產效率高、產品批間差異小的優勢在口蹄疫行業一經應用便迅速得到推廣，目前口蹄疫疫苗行業已經全部實現了生物反應器大規模懸浮培養。禽流感、狂犬、圓環等越來越多的疫苗品種正在試圖采用懸浮培養技術，它已經成為了企業轉型升級的一把利器。
生物反應器懸浮培養 BHK21細胞生產口蹄疫病毒是口蹄疫疫苗生產最普遍的方式 [5]。印度生產口蹄疫疫苗使用8 000 L 的生物反應器，中國和南美用3 000 ～ 5 000 L 的生物反應器生產口蹄疫疫苗。2009年，默克密理博和北京清大天一科技有限公司開發了 BHK21無血清培養基。 2010年蘭州百靈公司和宜興賽爾公司開發了適合口蹄疫疫苗生產的無血清培養基，使合作企業取得了無血清懸浮培養 BHK21細胞的口蹄疫疫苗生產批文。中空纖維生物反應器主要用于動物細胞無血清懸浮培養，這種生物反應器的主要優勢在于營養不間斷供應，從而防止代謝物的積累，在這樣的條件下培養細胞密度可達 109 /ml，因此中空纖維生物反應器應用很廣泛。
4 結語
貼壁培養型細胞可采用轉瓶培養、微載體培養、片狀載體籃式培養等，其中籃式培養操作簡單易控，可培養高密度生長的細胞，一般情況下，微載體培養細胞可擴增 10倍 [6，7]，而籃式培養可達 20倍左右 [8，9]。片狀載體可吸附脫落的細胞和宿主蛋白，易得到高質量的收獲液 [10]，缺點是難以放大，目前國內各企業均采用罐群進行規�；a。懸浮培養是細胞大規模培養的努力方向，但是細胞馴化和個性化培養基設計和優化技術難度較大。
動物細胞生物反應器大規模微載體培養時，有很多因素影響動物細胞的高密度增殖，包括 pH、溫度、溶解氧、營養素消耗、代謝物積累、血清、生長因子、細胞外基質、剪應力和細胞凋亡等。生物反應器通常具有探針或傳感器自動檢測活細胞的生長環境，對上述限制性因素實行計算機自動控制，包括通氣量、攪拌速度、懸浮均勻程度、pH 穩定性、溫度變化、罐壓、培養體積及溶氧供應等參數。細胞的培養環境直接影響產品的質量和數量，因此生物反應器的在線控制發揮著很重要的作用。——論文作者：阿爾祖古麗·阿依丁1 ，阿依木古麗1 ，喬自林1 ，馬桂蘭2*
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