發布時間：2022-03-21所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要: 對多粘類芽孢桿菌菌株 B - 306 的培養基配方及培養條件進行優化研究，優化后的多粘類芽孢桿菌 B - 306 培養基配方及培養條件為: 可溶性淀粉 17. 5 gL - 1 、蛋白胨 25. 0 gL - 1 、NaCl 1. 25 gL - 1 、Na2HPO4 0. 5 gL - 1 、CaCl2 1. 0 gL - 1 ，pH7. 5; 培養
摘要: 對多粘類芽孢桿菌菌株 B - 306 的培養基配方及培養條件進行優化研究，優化后的多粘類芽孢桿菌 B - 306 培養基配方及培養條件為: 可溶性淀粉 17. 5 g·L - 1 、蛋白胨 25. 0 g·L - 1 、NaCl 1. 25 g·L - 1 、Na2HPO4 0. 5 g·L - 1 、CaCl2 1. 0 g·L - 1 ，pH7. 5; 培養溫度 30 ℃、轉速 170 r·min - 1 、裝液量 80 mL/250 mL; 接種量為 10% ( 體積分數) . 經過以上條件優化，多粘類芽孢桿菌 B - 306 的細胞生物量可達 5. 3 × 109 cfu·mL - 1 ，比優化前 ( 3. 17 × 108 cfu·mL - 1 ) 提高了 15. 72 倍.
關鍵詞: 多粘類芽孢桿菌; 培養基配方; 培養條件; 優化
0 引言
多粘類芽孢桿菌( Paenibacillus polymyxa) 是一種產芽孢的 G + 細菌，對人或動植物沒有致病性，可產生多肽抗生素[1]、拮抗蛋白[2]、酶[3]、植物激素、絮凝劑[4]等多種生物活性物質，兼有生物農藥和生物菌肥的作用，已廣泛應用于農業[5]、工礦業[6]及廢水處理[7]等領域. 美國環境保護署( EPA) 已將其列為可在商業上應用的微生物種類之一，我國農業部也將其列為免做安全鑒定的一級菌種[8].
多粘類芽孢桿菌是一種植物根際促生細菌[9]，一方面可以用作微生物肥料，促進植物生長、提高作物產量[10 - 11]; 另一方面，可以有效防治植物細菌性和真菌性土傳病害，對植物青枯病、番茄枯萎病、油菜腐爛病、黑松根腐病等[12 - 13]多種植物病害具有很好的防治效果. 多粘類芽孢桿菌產生的多肽類抗菌物質對植物病原真菌具有很好的拮抗活性，且性質比較穩定，可用于多種植物病害的生物防治[14]. 因此，多粘類芽孢桿菌是一類極具開發前景和應用價值的生防細菌. 本研究對多粘類芽孢桿菌 B - 306 的培養基配方及培養條件進行優化，以提高多粘類芽孢桿菌 B - 306 的菌體產量.
1 材料與方法
1. 1 菌種
菌株 B - 306，本課題組從甘蔗渣田地中篩選獲得，并經鑒定為多粘類芽孢桿菌.
1. 2 牛肉膏蛋白胨培養基( g /L 蒸餾水)
牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂 15 ～ 20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH7. 0 ～ 7. 2，121 ℃滅菌 20 min. ( 液體培養基不加瓊脂，其他成分一樣)
1. 3 主要儀器設備
超凈工作臺( SW - CJ - 2FD 型，上海博迅實業有限公司醫療設備廠) ; 手提高壓蒸汽滅菌鍋( 01J2003 - 04 型，上海東亞壓力儀器制造有限公司) ; 隔水式生化培養箱( SHP - 250 型，上海精密實驗設備有限公司) ; 氣浴式恒溫搖床( DHZ - DA 型，太倉市實驗設備廠) ; 可見分光光度計( V - 1200 型，上海美譜達儀器有限公司) ; pH 計( PHS - 3C 型，上海精密科學儀器有限公司) .
1. 4 實驗方法
1. 4. 1 多粘類芽孢桿菌生長曲線測定
多粘類芽孢桿菌在 37 ℃下經牛肉膏蛋白胨培養基活化培養 24 h 后，以 5% ( 體積分數) 量接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基( 100 mL /250 mL) 中，在 30 ℃、200 r·min - 1 下培養，分別采用平板菌落計數法和分光光度法( 600 nm) 跟蹤測定多粘類芽孢桿菌 B - 306 細胞生物量( 單位為 cfu·mL - 1 : 菌落數/mL) 的變化情況，重復 3 次，取平均值，從而確定多粘類芽孢桿菌 B - 306 的生長曲線.
1. 4. 2 培養基成分的優化
1) 碳源種類對菌種細胞生物量的影響. 以液體牛肉膏蛋白胨培養基為基礎，選擇不同的碳源( 蔗糖、環糊精、麥芽糖、淀粉、乙酸鈉、葡萄糖) ，分別制成含 10 g·L - 1 單一碳源的培養基( 100 mL /250 mL) ，再將菌懸液以 5% ( 體積分數) 接種量接種到培養基中，置于30 ℃、200 r·min - 1 下培養18 h. 以 OD600增長量 ( 即菌種培養后 OD600值與菌種初始 OD600值之差) 為指標，每個實驗做 3 個平行( 下同) ，取平均值從而確定最佳的碳源種類.
2) 碳源添加量對菌種細胞生物量的影響. 在確定了最佳碳源種類的基礎上，考察 7. 5、12. 5、15、 17. 5、20、25 g·L - 1 不同碳源添加量對多粘類芽孢桿菌 B - 306 生長的影響，以 OD600增長量為指標，從而確定最佳的碳源添加量.
3) 氮源種類對菌種細胞生物量的影響. 在碳源優化的基礎上，選擇不同的氮源( 蛋白胨、磷酸二氫銨、氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉) ，分別制成含 10 g·L - 1 單一氮源的培養基，以 OD600增長量為指標，從而確定最佳的氮源種類.
4) 氮源添加量對菌種細胞生物量的影響. 在確定最佳氮源種類的基礎上，考察 2. 5、5、7. 5、10、 12. 5、15、17. 5、20、22. 5、25、27. 5、30 g·L - 1 不同氮源添加量對多粘類芽孢桿菌 B - 306 生長的影響，以 OD600增長量為指標，從而確定最佳的氮源添加量.
5) 無機鹽種類對菌種細胞生物量的影響. 在碳源和氮源優化的基礎上，分別以 5 g·L - 1 的磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀、鉬酸鈉、氯化錳、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸亞鐵為無機鹽添加到培養基中，以 OD600增長量為指標，從而確定最佳無機鹽.
6) 無機鹽添加量對菌種細胞生物量的影響. 采用正交試驗設計法，探討對菌體生長作用明顯的無機鹽配比及其交互作用對菌株 B - 306 細胞生物量的影響. 按照 L9 ( 34 ) 正交試驗表配制培養基，以 OD600增長量為指標，從而確定作用比較明顯的無機鹽的添加量.
1. 4. 3 培養條件的優化
1. 4. 3. 1 培養基初始 pH 對菌種細胞生物量的影響
在碳源、氮源和無機鹽優化的基礎上，調節多粘類芽孢桿菌 B - 306 的液體培養基初始 pH 分別為 4. 0、5. 0、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、9. 0，以 OD600增長量為指標，確定液體培養基的最佳初始 pH 值.
1. 4. 3. 2 溫度對菌種細胞生物量的影響
在培養基成分優化的基礎上，將多粘類芽孢桿菌 B - 306 分別置于 25、30、35、40、45 ℃ 下，在 200 r·min - 1 條件下培養，以 OD600增長量為指標確定最佳培養溫度.
1. 4. 3. 3 溶氧對菌種細胞生物量的影響
1) 轉速. 將多粘類芽孢桿菌 B - 306 以 5% 的量接種到已優化培養基成分的液體培養基中，置于 30 ℃，分別在 100、130、170、200、230、260 r·min - 1 的轉速下培養，以 OD600增長量為指標確定最佳轉速.
2) 裝液量. 在培養基成分以及溫度優化的基礎上，分別選取 40、60、80、100、120、140 mL /250 mL 不同的培養基裝液量，將多粘類芽孢桿菌 B - 306 置于30 ℃，轉速200 r·min - 1 ，以 OD600增長量為指標確定最佳裝液量.
1. 4. 3. 4 培養條件正交試驗
采用正交實驗設計法，探討溫度、轉速、裝液量、培養基初始 pH 對菌種生長的影響，按照 L27 ( 313 ) 正交試驗表配制培養基，在相應的條件下培養，以 OD600增長量為指標確定多粘類芽孢桿菌 B - 306 最佳培養條件.
1. 4. 3. 5 接種量對菌種細胞生物量的影響
在培養基成分和培養條件優化后的基礎上，將活化好的種子液分別以 1% 、3% 、5% 、10% 、15% 、 20% ( 體積分數) 的接種量接種到液體培養基中，以 OD600增長量為指標確定多粘類芽孢桿菌 B - 306 最佳接種量.
相關期刊推薦：《福州大學學報(自然科學版)》(雙月刊)創刊于1961年，是由福州大學主辦的學術刊物。主要刊載數學、物理、電氣、信息科學與技術、自動控制、機械、材料、土木建筑、化學化工、生物、輕工、資源、環保等學科的最新研究成果。
2 結果與分析
2. 1 多粘類芽孢桿菌生長曲線的測定測定
不同培養時間下 OD600值和菌落數，以培養時間為橫坐標、分別以 OD600值和菌落數為縱坐標繪制生長曲線圖( 圖 1) . 由生長曲線確定多粘類芽孢桿菌 B - 306 的最佳培養時間為 18 h.
2. 2 多粘類芽孢桿菌的培養基優化
2. 2. 1 碳源種類對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響
分別以蔗糖、環糊精、麥芽糖、可溶性淀粉、乙酸鈉、葡萄糖為碳源，考察它們對多粘類芽孢桿菌 B - 306 細胞生物量的影響，以碳源種類為橫坐標，OD600增長量為縱坐標作圖( 圖 2) . 由圖 2 知，以可溶性淀粉為碳源時，多粘類芽孢桿菌的 OD600增長量最大，為 1. 184; 而用乙酸鈉和葡萄糖作為碳源時，OD600 增長量較小. 綜合細胞生物量和培養基成本進行考慮，確定采用可溶性淀粉作為碳源.
2. 2. 2 碳源添加量對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響
比較可溶性淀粉不同添加量對多粘類芽孢桿菌 B - 306 生長的影響，以碳源添加量為橫坐標，OD600增長量為縱坐標作圖( 圖 3) . 結果表明，隨著可溶性淀粉添加量的增加，OD600增長量也不斷提高，當碳源添加量為 17. 5 g·L - 1 時，多粘類芽孢桿菌的 OD600增長量達到最高，為 0. 982. 隨之繼續增加可溶性淀粉的添加量，OD600增長量緩慢下降. 因此，確定多粘類芽孢桿菌可溶性淀粉的最適添加量為 17. 5 g·L - 1 .
2. 2. 3 氮源種類對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響
氮源為微生物生長提供營養所需的氮元素，氮素對微生物的生長發育有著重要的意義，主要用于菌體細胞物質( 氨基酸、蛋白質、核酸等) 和含氮代謝物的合成. 有機氮源營養豐富，除含有豐富的蛋白質、肽類、游離的氨基酸以外，還含有少量的糖類、脂肪和生長因子等. 由于有機氮源成本較高，本研究主要以無機氮源為主，以氮源種類為橫坐標，OD600增長量為縱坐標作圖( 圖 4) . 結果表明，菌種利用蛋白胨作為氮源時，OD600增長量最高，為 0. 942; 而采用無機氮源時，細胞生物量相對較低，因此選取蛋白胨作為培養基的氮源.
2. 2. 4 氮源添加量對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響
以蛋白胨添加量為橫坐標，以菌懸液稀釋 10 倍后的 OD600增長量為縱坐標作圖( 圖 5) . 結果表明，隨著蛋白胨添加量的增加，OD600增長量也隨之提高; 當蛋白胨添加量為 25. 0 g·L - 1 時，多粘類芽孢桿菌的 OD600增長量達到最高，為 0. 679; 隨后繼續增加蛋白胨的添加量，OD600增長量有所下降. 因此，確定多粘類芽孢桿菌 B - 306 的蛋白胨添加量為 25. 0 g·L - 1 .
2. 2. 5 無機鹽種類對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響
以無機鹽種類為橫坐標，以菌懸液稀釋 10 倍后的 OD600增長量為縱坐標作圖( 圖 6) . 結果表明，當以 NaCl、Na2HPO4 和 CaCl2 作為無機鹽時，多粘類芽孢桿菌的 OD600 增長量較大，分別為 1. 101、0. 825、 0. 748，因此選擇 NaCl、Na2HPO4 和 CaCl2 作為多粘類芽孢桿菌 B - 306 培養的最佳無機鹽. 在確定最佳無機鹽種類的基礎上，進一步深入研究無機鹽的最適添加量及其相互作用.
2. 3 多粘類芽孢桿菌培養條件的優化
2. 3. 1 培養基初始 pH 值對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響以培養基初始 pH 值為橫坐標，以菌懸液稀釋 10 倍后的 OD600增長量為縱坐標作圖( 圖 7) . 結果表明，隨著培養基初始 pH 值的升高，其 OD600增長量也隨之增加; 當在 pH7 ～ 8 內時，多粘類芽孢桿菌的 OD600增長量都較高，當 pH 值為 7. 5 時，達到最高，為 0. 616. 繼續升高培養基 pH 值，OD600增長量下降，因此，確定多粘類芽孢桿菌 B - 306 的最佳培養基初始 pH 值為 7. 5. 2. 3. 2 溫度對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響溫度是影響微生物生長的重要因素，它的改變會影響微生物體內所進行的多種生物化學反應. 溫度對微生物的影響是廣泛的，在一定范圍內，適宜的溫度能促進生長，不適的溫度會改變微生物的形態和代謝. 以培養時間為橫坐標，以菌懸液稀釋 5 倍后的 OD600增長量為縱坐標作圖( 圖 8) . 結果表明，當溫度為 30 ℃時， 多粘類芽孢桿菌的 OD600值最高，為 0. 610. 因此，確定 30 ℃為多粘類芽孢桿菌 B -306 的最適培養溫度.
2. 3. 3 溶氧對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響
2. 3. 3. 1 轉速對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響
溶氧對于微生物的生長和代謝產物的積累有重要的影響，它主要從兩個方面來考察，即轉速和培養基裝液量. 以轉速為橫坐標，以菌懸液稀釋 10 倍后的 OD600增長量為縱坐標作圖( 圖 9) . 結果表明，隨著轉速的增加，多粘類芽孢桿菌的 OD600增長量上升，當轉速為 170 r·min - 1 時，OD600增長量達到最大值，為 0. 620. 當繼續增加轉速到 200 r·min - 1 時，OD600增長量開始下降. 因此，選擇 170 r·min - 1 為多粘類芽孢桿菌 B - 306 培養的最佳轉速.
2. 3. 3. 2 培養基裝液量對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響
以培養基裝液量為橫坐標，以菌懸液稀釋 10 倍后的 OD600增長量為縱坐標作圖( 圖 10) . 結果表明，裝液量對菌種的生長影響不大，當裝液量為 80 mL /250 mL 時，OD600的增長量最高，為 0. 861，因此，選擇 80 mL /250 mL 作為培養基的初始裝液量.
2. 3. 4 培養條件正交試驗
設計正交試驗 L27 ( 313 ) 對多粘類芽孢桿菌 B - 306 的培養條件進行優化，以考察溫度、培養基初始 pH、轉速、裝液量四個因素對菌株生長的影響，根據單因素的實驗優化結果選取因素水平，正交試驗設計及分析見表 3、表 4 和表 5.
從表 5 可以看出，溫度對多粘類芽孢桿菌 B - 306 的生長具有顯著性影響，其他三個因素影響不顯著. 從表 4 中可以看出，影響菌體生長的最佳組合為 A2B2C2D2，而正交表中 OD600增長量最高的為 A2B2C2D1，兩種組合的差別在于裝液量的多少之差，因此從節約生產成本的出發點考慮，選擇 A2B2C2D2 為 最 佳 組 合，即 溫 度 30 ℃，pH7. 5，轉 速 170 r·min - 1 ，裝液量 80 mL /250 mL.
2. 3. 5 接種量對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響
以接種量為橫坐標，以菌懸液稀釋 10 倍后的 OD600 增長量為縱坐標作圖( 圖 11) . 結果表明，接種量為 10% ( 體積分數) 時，OD600增長量最大，為 0. 584. 因此，確定多粘類芽孢桿菌 B - 306 的最佳接種量為 10% .——論文作者：陳小煌1 ，李自然1 ，黃小云1 ，葉秀云1 ，劉 波2 ，林 娟1
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