發布時間：2021-09-30所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要[目的]評定液相色譜-串聯質譜法測定三文魚中生物胺的不確定度。[方法]樣品經過5%三氯乙酸提
摘要[目的]評定液相色譜-串聯質譜法測定三文魚中生物胺的不確定度。[方法]樣品經過5%三氯乙酸提取、正己烷除脂、丹磺酰氯丙酮溶液衍生化后，液相色譜-串聯質譜分析三文魚中9種生物胺的含量，對方法相對標準不確定度、標準不確定度、擴展不確定度進行評估。[結果]色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、組胺、精胺、亞精胺、去甲基腎上腺素的平均值分別為4.30、5.59、5.72、6.21、4.85、5.48、7.18、6.79、4.77mg/kg，擴展不確定度分別為0.46、0.56、0.48、0.54、0.42、0.50、0.64、0.55、0.41mg/kg(k=2)。[結論]標準儲備液的配制、稀釋以及標準曲線的線性擬合對不確定度的貢獻值最大，建議選用精度好的量器，規范試驗操作與前處理步驟。
關鍵詞三文魚;生物胺;液相色譜-串聯質譜;不確定度
三文魚是鮭科魚，主要分布在大西洋、太平洋和歐洲北極的海岸[1]。三文魚味道鮮美、營養豐富，不飽和脂肪酸(DHA、EPA、DPA)、蛋白質及維生素等含量豐富[2]，有助于兒童智力發育、預防心血管疾病、降低癌癥發病率等[3]。我國冰鮮三文魚進口量逐年增加，三文魚消費市場龐大[4]。但是在貯存運輸過程中，三文魚肌肉組織在微生物的作用下，極易發生蛋白質的分解、腐敗變質，產生生物胺等有毒代謝物[5]。生物胺是極性或半極性化合物的氮化有機堿，根據其結構差異，可以分為3類:脂肪族生物胺(如腐胺、尸胺、亞精胺、精胺、胍基丁胺等[6-7])、芳香族生物胺(如酪胺、苯乙胺、苯甲胺等[8])、雜環胺(如組胺、色胺、5-羥色胺等[9])。
目前多種方法用于測定食品中的生物胺，如液相色譜-串聯質譜[10]、高效液相色譜[11]、薄層色譜[12]、毛細管電泳[13]、氣相色譜、氣相色譜-串聯質譜[14]、生物傳感器[15]和ELISA[16]等。其中液相色譜-串聯質譜法可對食品基質中的生物胺快速準確地定量分析。Nalazek-Rudnicka等[17]基于LC-MS/MS分析啤酒樣品中測定生物胺的差異，方法的檢出限和定量限分別是0.54～4.30、1.60～13.00ng/mL，該方法靈敏度高、特異性好。Ochi[18]通過反相液相色譜-串聯質譜法測定咸鯖魚中的腐胺、色胺、酪胺、組胺、β-苯乙胺、精胺、亞精胺、尸胺，8種分析物的平均回收率均在87%～118%，對生物胺快速準確進行定量分析。Gosetti等[19]建立了一種LC-MS/MS法同時測定尿液中16種生物胺，方法的檢出限和定量限分別是0.3～6.6、1.0～21.9μg/L，平均回收率在72.9%～100.0%。
測量不確定度是說明測量結果質量的參數，用來表征合理、賦予被測量數值分散性[20]，用于評價測量結果的可信性、有效性、科學性，代表實驗室測量水平[21]。但是目前評定液相色譜-串聯質譜法測定三文魚中生物胺的不確定度的報道較少。余曉薇等[22]通過高效液相色譜法對魚和蝦中的組胺含量進行測定，建立組胺不確定度分析方法。胡禮淵等[23]對GB/T20768—2006《魚和蝦有毒生物胺的測定原理》進行不確定度評價，建立水產品中組胺含量不確定度評定方法。筆者根據《測量不確定度標示指南》和JJF1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》，對液相色譜-串聯質譜法測定三文魚中生物胺的不確定度進行分析，以期為三文魚中生物胺準確測定提供依據，也為實驗室質量控制提供參考。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1主要試劑。組胺(His)、精胺(Spe)、亞精胺(Spd)、尸胺(Cad)、腐胺(Put)、酪胺(Tyr)、色胺(Trp)均購自Bepure公司;β-苯乙胺(Phe)、去甲基腎上腺素(Ne)標準品購自上海吉爾生化有限公司;丹磺酰氯(LC-MS級)購自Sigma-Aldrich公司;乙腈(LC-MS級)、甲醇(HPLC級)、正己烷(HPLC級)均購自Thermofisher公司;高氯酸(分析純)、三氯乙酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、碳酸氫鈉(分析純)、氨水(分析純)、鹽酸(分析純)均購自國藥集團化學試劑有限公司。
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1.1.2主要儀器。UPLC-XevoTQ-S超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜儀，購自美國Waters公司;ACQUITYUPLCHSST3(2.1mm×100mm，1.8μm)色譜柱，購自美國Waters公司;ZWF-110X30恒溫水浴搖床，購自上海智城分析儀器制造有限公司;CF16RXⅡ離心機，購自日本HITACHI公司。
1.2方法
1.2.1標準溶液的配制。
1.2.1.1標準儲備液的配制。稱取色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺標準品適量，用0.1mol/LHCl配制成質量濃度各為1mg/mL的標準儲備液，置于-20℃冰箱儲存備用，保存期為4個月。1.2.1.2混合標準系列溶液的配制。臨用前配制。取“1.2.1.1”儲備液1mL，用0.1mol/LHCl稀釋至100mL，得到10μg/mL的中間液，取標準品儲備液0、10、50、100、500、1000、2000μL用0.1mol/LHCl定容至10mL，得到濃度為0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00μg/mL的混合標準溶液。.
1.2.2樣品制備。
1.2.2.1樣品提取。準確稱取5.0g代表性均質化樣品置于50mL離心管中，加入15mL5%三氯乙酸溶液，渦旋1min，超聲10min，10℃下8000r/min離心5min，上清液轉移至50mL離心管中。殘渣中加入10mL5%三氯乙酸溶液，渦旋1min，超聲10min，10℃下8000r/min離心5min，合并上清液于上述離心管，待凈化。
1.2.2.2樣品凈化。向上述試樣提取液中加入20mL正己烷，渦旋振蕩5min，10℃下8000r/min離心5min，棄去上層有機相，下層試樣溶液加入20mL正己烷再除脂一次，下層試樣溶液轉移至25mL容量瓶用5%三氯乙酸溶液定容至刻度，待衍生。
1.2.2.3樣品衍生。分別移取上述提取液和生物胺標準系列溶液各0.1mL，置于2mL離心管中，依次加入100μL飽和碳酸氫鈉溶液、20μL1mol/L氫氧化鈉溶液和0.1mL丹酰氯溶液(10mg溶于1mL丙酮溶液)，蓋塞封口，60℃避光反應25min。反應完畢后，加入10μL氨水，60℃避光反應15min終止反應，氮氣吹干后用乙腈定容至1mL，過0.2μm聚丙烯濾膜(GHP)濾膜后，待液質聯用儀測定。
1.2.3色譜條件。色譜柱為WatersACQUITYUPLCBEHShieldRP18柱(2.1mm×150mm，1.7μm);流動相A相為含0.1%甲酸的50%乙腈水溶液，B相為乙腈;柱溫30℃;流速0.3mL/min，進樣量5μL;流動相梯度見表1。
1.2.4質譜條件。掃描方式為電噴霧正離子(ESI+)掃描;檢測方式為多反應監測(MRM);毛細管電壓3.0kV;離子源溫度120℃;脫溶劑氣流量1000L/h，脫溶劑氣溫度500℃，錐形氣體流速150L/h。質譜檢測參數見表2。
2結果與分析
2.1不確定度的識別和來源依據測定步驟，對三文魚中生物胺測定結果的不確定度的來源分析見圖1。
2.2不確定度的分析
2.2.1被測定物質量濃度u(C)。標準儲備液的配制、稀釋以及標準曲線的線性擬合是影響被測定物質量濃度(C)帶來的不確定度的主要過程。
3結論
該試驗評價了三文魚中生物胺的液相色譜-串聯質譜法的不確定度，色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、組胺、精胺、亞精胺、去甲基腎上腺素的含量分別為4.30±0.46、5.59±0.56、5.72±0.48、6.21±0.54、4.85±0.42、5.48±0.50、7.18±0.64、6.79±0.55、4.77±0.41mg/kg。結果表明，試驗操作步驟中會多方引入不確定度，分析發現標準儲備液的配制、稀釋以及標準曲線的線性擬合對不確定度的貢獻值最大，回收率次之。在試驗過程中，操作人員熟練水平的提升、儀器的及時維護、平行樣本測定次數的增加等方法可減小測量結果的不確定度。——論文作者：鄭越男1，曹進2*，孫珊珊2，郭亞輝1，羅嬌依2，錢和1
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