發布時間：2021-09-30所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要煙草中多酚類物質的種類及含量對烤后煙葉的香氣品質、煙葉色澤及香吃味有重要影響，有效提取分離與確定煙草中的多酚類物質可提高烤后煙葉的品質，增加煙草制品的經濟利用價值。本文詳細介紹了溶劑萃
摘要煙草中多酚類物質的種類及含量對烤后煙葉的香氣品質、煙葉色澤及香吃味有重要影響，有效提取分離與確定煙草中的多酚類物質可提高烤后煙葉的品質，增加煙草制品的經濟利用價值。本文詳細介紹了溶劑萃取、超聲輔助提取、微波輔助提取和超臨界流體萃取四種提取煙草多酚的常用方法，以及高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)和近紅外光譜法三種測定煙草多酚的分析方法，綜述了提取分離及分析煙草多酚新技術的研究現狀，同時對各方法的優缺點進行比較，并探討了當前亟待解決的問題及工業化利用前景，使煙草多酚能更廣泛地應用于食用、藥用等領域，增加煙草多酚的實際應用價值。
關鍵詞煙草多酚類物質提取分離分析檢測
煙草作為我國重要的工業性原料作物，對我國農產品財政收入貢獻較大[1]。據資料報道，煙草中所能測出的化合物約有300多種[2]，其中多酚類物質能達煙葉干重的0.5%～6%[1]，含量較為豐富，對煙葉以及煙草制品燃吸后產生的煙氣進行檢測，已檢測到的多酚可達280多種[3]。煙草中占比最多的三種多酚為綠原酸、蕓香苷和莨菪亭[4]，其中綠原酸含量可達煙草總多酚含量的75%～95%[5]。煙草中多酚類物質的種類及含量對煙葉色澤、卷煙香氣、卷煙吸味有著重要影響，是評估煙草制品的重要品質標準[6～8]。所以，有效提取分離與研究煙草中的多酚類物質，并將其應用到食品、醫藥保健等領域，不僅能提高煙草相關產品的品質標準，還能增加煙草制品的經濟利用價值。
多酚是一類植物次生代謝物質，屬于植物單寧類，含有多個酚羥基結構，在植物的葉片中最為常見[9]。植物多酚能使機體內自由基得到有效清除，機體衰老進程得以緩解[10]，心腦血管等慢性疾病得到有效預防[11]，能抵抗神經性疾病[12]，降低癌癥風險[13]等，因此在營養食品、醫藥保健等領域常被用作抗氧化劑、抑菌劑、防腐劑等。本文主要綜述了煙草中多酚類物質的有效提取分離與檢測方法，介紹了國內外關于煙草多酚的研究現狀，以期為煙草多酚的后續獲取利用和工業化生產提供參考。
1煙草中多酚的提取分離技術
1.1有機溶劑提取法
溶劑萃取的關鍵在于要根據相似相溶性特征選擇與煙草中待提取活性成分的性質相對應的溶劑。多酚類物質中含有酚羥基極性基團，選擇針對其溶解度較好的甲醇、丙酮作溶劑效果較好[14]。為防止多酚分子發生醇解反應，通常選用丙酮-水體系為溶劑，所提多酚多為倍酸酯多酚;若選用弱酸性醇-水體系為溶劑，所提物質多為單寧類多酚。pH在酸性范圍時，多酚大多以分子形式存在于植物體中，pH在堿性范圍時，則多數為負離子狀態，因此，可調節萃取劑的pH選擇性萃取不同組分。此外，可依據目標多酚的分子量差異選擇合適的萃取溶劑，若所提多酚分子量較低，可選用乙醚為溶劑;若所提多酚為中等分子量多酚(單寧類)，既可選用乙酸乙酯作溶劑，也可選擇丙酮水溶液作溶劑;當所提多酚分子量在1500左右時，可選用水作溶劑;而大分子量多酚在熱堿溶液中提取效果較好[15]。有機溶劑萃取法操作便捷、成本低、溶劑易回收、工業放大容易，但萃取物中往往含有多種化學性質相似的成分，導致有效成分含量較低，且提取效率不高、耗時較長、溶劑殘留較多，所以，通常采用溶劑提取法對煙葉中的化學成分進行粗提，之后再根據需要對粗品進行純化。由于煙草制品主要為吸食性消費品，選擇溶劑時必須考慮對人體健康的影響，綠色、無毒、無污染的乙醇-水體系常常成為首選提取劑。
1.2超聲輔助提取法
超聲波具有強空化作用，會產生高速微射流及強剪切力，促使物質破壁而出，能增強植物成分溶出的速率，常常輔助于溶劑提取法。超聲波輔助提取法可加速萃取時間，所需溫度較低，萃取效率高，能極大地降低溶劑的使用體積和成本[16]，較常見于提取植物中的天然活性成分。陳森林等采用響應面Box-Behnken中心組合研究優化超聲輔助提取煙葉多酚的工藝，確定最終提取溶劑為40%～80%乙醇水溶液，料液比10～30mL/g，在50℃條件下50W提取30～45min，所得萃取物含8種多酚類致香前體物質(綠原酸、莨菪亭、咖啡酸、香豆素、蕓香苷、新綠原酸、莰菲醇-3-0-蕓香糖苷、隱綠原酸)，每克煙葉中的總多酚含量可達44.28mg[17，18]。Gu等[19]研究了一種動態超聲輔助提取干煙葉中多酚的方法，以甲醇(含0.5%抗壞血酸)為溶劑，超聲振動頻率為35kHz，35℃下用6mL溶劑(流量0.5mL/min)萃取10min，所得提取物中含綠原酸、艾蒿素、蘆丁、東莨菪素和槲皮素等5種多酚。與靜態超聲輔助提取法相比，提取多酚所需時間從30min縮短為10min，回收率由85%顯著提高到96%，所提取5種多酚的總含量由2.150mg/g增加為2.225mg/g，且溶劑消耗也大大減少，說明動態超聲輔助提取明顯優于靜態超聲輔助提取。由于超聲波衰減因素的存在，會導致大直徑提取罐周壁形成一個無空化效應的超聲空白區域，僅使一環形空間可得到超聲的有效影響;另外，較高的設備成本以及設備易損性也制約了超聲波輔助在實際工業生產過程中的應用。
1.3微波輔助提取法
微波與物料的相互作用及其強度取決于物料的介電特性，微波穿透低介電損耗物料時，微波能吸收較低;穿透高介電損耗物料時吸收的微波能呈先增后減趨勢;穿透非介電損耗物料時幾乎不吸收微波能。因此，介電特性與物料的化學成分有較大相關性，微波輔助適應的場所需與物料的介電特性匹配。微波輔助溶劑萃取的本質在于微波強化了傳熱傳質作用，避免了熱對流、熱傳導和熱輻射等方式中的能量損失，使物料加熱更快、更均勻，從而強化傳質過程，有利于物質的溶出。某些場合，微波萃取過程中產生的高壓允許溶劑在超過常壓沸點的溫度下仍處于液體狀態[20]，對溶解過程十分有利。關于微波輔助提取天然產物中化學成分已有系列研究報道[21]。王海燕等[22]以提高總多酚提取率為目標，探究出提取烤煙煙葉中綠原酸、蕓香苷的微波輔助提取條件:所用溶劑為53%甲醇(11mL/g)，560W微波輻照提取70s，每克煙葉中所提總多酚量可達22.38mg。Chen等[23]通過微波輔助提取煙草多酚，若溫度達到120℃或更高，萃取時間可短至6min，并能萃取出更多的熱降解成分。已有報道表明，微波輔助萃取法提取時間較短、溶劑需求較少、效率高、能耗低，但由于物料的不均勻性，不能使所有物料接收到同等微波輻照，整個體系受熱不均，從而導致物料的部分區域提取不充分，工藝放大難;當提取溶液為有機溶劑時，防爆問題更為凸顯，整個實驗過程安全性和不穩定性因素較多。至今，微波輔助提取煙草多酚還僅限于實驗室階段。
1.4超臨界流體萃取法
超臨界流體萃取技術(Supercriticalfluidextraction，SFE)可將有效成分的提取和分離結合于一體，依據超臨界流體在其臨界壓力及臨界溫度以上對天然產物中的低沸點或熱敏性有效成分具有較強溶解能力進行分離[24]。楊菁等[26]采用GC-MS檢測了超臨界流體萃取的煙梗中的成分，主要分為五類致香成分:美拉德及焦糖化反應相關中性化合物、堿性化合物、酚類物質、酸類和煙草本香類物質，其中酚類物質主要為4-乙烯基愈創木酚。并且隨溫度逐漸升高，一些碳水化合物會發生焦糖化反應，生成小分子有機酸、羰基化合物和呋喃類等揮發性產物。趙卉[27]探索的超臨界CO2萃取煙葉中茄尼醇的優化工藝條件為:以95%乙醇作夾帶劑，在萃取壓力20MPa、溫度45℃、分離壓力5MPa、溫度35℃、CO2流量4.8L/h條件下萃取3h，茄尼醇的提取率達94.0%，提取物中茄尼醇的含量達33.0%。超臨界萃取技術已被廣泛應用于煙草加工業中，主要用于提取茄尼醇和尼古丁等化合物，以及萃取煙草中的低沸點多酚及其轉化產物。
1.5其他新技術
近年來，除了上述煙草多酚的常用提取方法，一些新技術如加壓液相萃取法、深共熔溶劑萃取法、酶輔助提取法及電滲析提取法等逐漸應用于煙草多酚的提取實驗中。
1.5.1加壓液相萃取技術
加壓液相萃取是通過高溫高壓加快萃取進程和提高產量的一種萃取技術。高溫高壓能增加傳質速率、增大化合物的擴散和溶解度、降低溶劑粘度，進而影響萃取動力學。此外，在萃取過程結束后不需過濾萃取物，其原料仍可保留在萃取池中，操作過程簡單。并且該技術的效率高，溶劑消耗低，可使用環境友好型溶劑，如水或乙醇。Shifflett等[28]成功將加壓液相萃取法應用到煙葉多酚的提取中，通過超高效液相色譜-電噴霧電離串聯質譜技術測定出綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、蘆丁、莨菪亭、煙花苷六種多酚在烤煙煙葉、調制煙葉、晾干煙葉中的總含量分別為18～41mg/g、5～27mg/g和0.5～3mg/g。加壓液相萃取法與固相萃取技術相結合，可實現多酚物質及其他化合物的完全分離[29]。Chen等[30]經過加壓液相萃取和固相萃取純化，對干煙草和烤煙煙葉中的多酚進行了提取與鑒定，以含0.5%抗壞血酸的無水甲醇為溶劑，在40℃條件下提取10min，確定了煙草中含有綠原酸、七葉亭、東莨菪內酯、蘆丁、槲皮素五種多酚。
1.5.2深共熔溶劑提取法
深共熔現象又稱低溫共熔，是以一定摩爾比的氫鍵受體和氫鍵供體為原料，按照一定比例反應，制備成可使反應物熔點下降的低溫共熔混合物的現象。Abbott等[31]研究表明，可加熱季銨鹽(氫鍵受體)和酰胺類(氫鍵供體)化合物形成低溫共熔體系，二者并稱為深共熔溶劑。深共熔溶劑體系的熔點較低(大都低于95℃)，分離過程的操作溫度范圍較廣，使傳輸介質過程更易進行[32];深共熔溶劑的黏度范圍在500mPa·s以下，隨溫度升高，體系的氫鍵供體含量會越高，黏度也隨之下降。深共熔溶劑被認為是替代有機溶劑的最佳選擇[33]，能穩定維持在較寬電位范圍內，蒸氣壓較低，不易燃燒，導電性能良好，同時合成成本低、合成路線簡單、無毒環保等優點也對其發展更為有利[34，35]。尚憲超等[36，37]成功探究了超聲輔助深共熔溶劑(含40%水)提取干煙葉中綠原酸和蕓香苷的方法，通過混合加熱蘋果酸(供體)和氯化膽堿(受體)形成深共熔溶劑，在50℃條件下萃取30min，每克煙葉中所提取綠原酸、蕓香苷量分別可達16.95和8.53mg，其提取效果及回收率均優于有機溶劑萃取。
1.5.3酶輔助提取法
酶輔助提取法首先需要利用一種酶或多種酶聯合(纖維素酶和果膠酶)對實驗原料進行預處理，然后再以醇類溶劑進行提取。劉佳佳等[38]驗證了采用酶輔助提取法以金銀花為原料提取綠原酸，相比乙醇索氏提取法所提綠原酸得率提高約25.97%。該方法反應條件溫和，纖維素酶處理可加速溶出胞內物質(如綠原酸)，可有效提取植物多酚，但鮮有文獻報道將酶輔助提取法用于提取煙草多酚的實驗中;且采用酶輔助提取法操作較為繁瑣，經濟成本較高。
1.5.4電滲析分離技術
電滲析采取在溶液中通直流電的方式，使溶液中的(帶電)離子物質從一種溶液穿過一種或多種選擇性滲透膜轉移到另一種溶液中，從而實現電化學分離[39]。離子交換膜的性質主要取決于聚合物基質的類型和固定離子團的濃度及類型，聚合物基體交聯的程度決定了結構基體的離子約束水平及其孔隙率和孔徑，孔隙大小會影響離子的滲透性，從而依據選擇性滲透原理達到分離目的[40]。由于多酚分子帶有電荷，在電滲析器中循環煙草提取物，多酚可以沿電場梯度移動，穿過膜并離開主體溶液，從而選擇性分離多酚。Bazinet等[41]利用煙草中多酚電遷移的差異性成功分離出綠原酸、蘆丁和東莨菪內酯。
相關知識推薦：怎么選好投稿的雜志發表論文
綜合對比以上提取方法，各方法都存在其自身的優勢及缺陷。溶劑浸取法工業放大容易，可一次性大量提取煙草多酚;超聲輔助提取法是目前實驗室及工業化提取煙草多酚的較常用方法，該方法所提取煙草多酚種類較多，工業操作簡便，提取率較高;微波輔助法一次性提取速度快，可大大降低實驗的時間成本;超臨界流體萃取技術將萃取、分離過程相結合，可簡捷高效提取低沸點多酚;加壓液相萃取技術與固相萃取技術相結合可實現多酚與其他化合物的完全分離，大大提高所提取多酚的純度;深共熔溶劑提取法綠色無污染，所使用溶劑易回收，可減少后處理操作步驟;酶輔助提取法反應條件較溫和，可降低煙草多酚降解的可能性;電滲析分離技術可選擇性分離煙草中的多酚及其他化合物，簡化后續純化步驟。根據所需提取的多酚物質種類及所需達到的目標要求選擇合適的實驗室提取工藝或工業化提取方案，會極大提高提取效率，降低實驗成本。
1.6煙草中多酚的分離純化方法
對于煙草中多酚物質的研究，大多局限于提取層面，不能將多酚物質完全分離開，對煙草多酚后續的分析與應用限制較大。近年來，對煙草中多酚的分離純化研究得到廣泛關注，普遍應用大孔樹脂吸附、固相萃取、超濾法和層析法純化煙草多酚，其中尤以大孔樹脂吸附最為常用且分離效果最好，大孔樹脂可在短時間內快速吸附較大容量的溶液，選擇性好，不易受無機物影響，解析率高，再生簡單，是一種新型分離材料，適于工業化生產[42]。張獻忠等[43]以廢次煙葉中所提多酚為原料，對比了6種大孔樹脂吸附和解吸煙草多酚的效果差異，驗證了D101大孔樹脂能夠較好的富集純化煙草多酚，優化出利用大孔樹脂純化多酚的操作條件為，提取液濃度2.5mg/mL，pH4.0，上樣液流速2.0mL/min，以80%乙醇為洗脫液，流速2.0mL/min，在此條件下，純化效果最好，煙草多酚的動態回收率達70.37%。此外，固相萃取技術具有耗時短、操作便捷等優點，能選擇性地將目標組分與干擾物質分離，Chen等[30]應用固相萃取技術清除提取物中的脂類化合物，選用C18固相萃取柱，以3mL0.01mol/L的鹽酸洗滌后，用20mL甲醇洗脫，實現了對煙草中綠原酸、七葉亭、東莨菪內酯、蘆丁、槲皮素五種多酚的純化�？傮w而言，煙草中多酚的進一步分離純化對煙草工業化應用具有重要意義，將會成為該領域研究的新焦點。
2煙草中多酚的分析檢測方法
多酚物質的定性定量以及結構分析對于煙草多酚的功能活性評價至關重要，由此，確定一種高靈敏度和高選擇性的多酚分析方法至關重要，研究人員也不斷開發出新方法新技術用于多酚成分的分析。目前較常使用高效液相色譜(HPLC)法測定單體酚，利用HPLC-串聯質譜法鑒別與分析新化合物，以及采用近紅外光譜法測定煙草中的多酚總量。
2.1HPLC法
HPLC法定量準確、靈敏度高，通過與標準物質的保留時間進行比對確定單體酚組成，該方法是目前測定分析植物多酚較為常用的方法。在測定過程中，通常將適量酸性抑制劑(如甲酸、乙酸、磷酸和三氟乙酸等)加入到流動相中，以此減弱酚酸類化合物的電離，獲得較好的出峰效果。沈進等[44]用HPLC法選用Agilent1100NovaPakC18柱(3.9×150mm)，分別以甲醇、磷酸二氫鉀緩沖溶液(0.05mol/L)為流動相，在345nm以0.5mL/min進行梯度洗脫，定量測定出了不同煙葉中的綠原酸、莨菪亭、隱綠原酸、蕓香苷和新綠原酸5種多酚。余小芬等[45]選用SunFireC18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，在340nm以甲醇/乙酸(98∶2)、水/乙酸(98∶2)為流動相進行梯度洗脫，利用HPLC法同時定量測定了所提綠原酸、莨菪亭和蕓香苷。HPLC對于低分子量煙草多酚的檢測效果較好，卻不能準確測定出復雜結構的大分子量多酚物質。
2.2高效液相色譜-串聯質譜法
HPLC需串聯質譜使用才能鑒定出復雜結構的未知化合物，液質聯用技術是目前測定植物多酚成分的有效方法。電噴霧技術屬于軟電離質譜技術，通過提高源內錐孔電壓使被測化合物在離子源內發生碰撞誘導裂解，通過碎片離子確定所測物質的分子量，從而實現化合物的結構鑒定，必要時需通過正負兩種模式進行驗證[46]。Zhong等[47]利用HPLC-ESI-MS法測定研究了煙草中的多酚類物質，成功將該方法應用于定性定量分析煙草中的多酚類物質中�？坠廨x等[48]選用WatersBEHC18色譜柱(15cm×2.1mm，1.7μm)，以含0.1%甲酸和0.2mmol/L醋酸銨的水和乙腈作流動相，以0.25mL/min梯度洗脫;質譜分析噴霧電壓為4kV，簾氣壓力為0.276MPa，電噴霧離子源溫度為700℃，輔助氣1(413kPa)，輔助氣2(344kPa)，去簇電壓為100V，定量分析出煙葉中的18種多酚。該方法操作簡捷、定性定量準確，有利于對煙草多酚的后續分析。
2.3近紅外光譜法
有機分子中的C-H、N-H、O-H和C-O等基團在近紅外區域范圍內會吸收基頻的振動倍頻與合頻，包含豐富的信息，所以，與這些基團有直接或間接關系的成分可利用近紅外光譜技術測出[49]。該方法具有方法精度高、穩定性好、能降低檢測成本等優點，測定煙草多酚的效果較好。章平泉等[50]建立了關于卷煙中多酚(綠原酸、新綠原酸和蕓香苷)含量的近紅外數學模型，將所建立的模型預測值與化學值進行比較得，新綠原酸和蕓香苷的最大相對誤差均在5%以內，綠原酸平均相對誤差最小為1.66%，蕓香苷的平均相對誤差最大為2.88%，但在5%范圍內，說明用近紅外數學模型預測的準確度接近化學方法，驗證該模型具有良好的準確性和穩定性，可快速、準確測定出卷煙中多酚類物質的含量。吳玉萍等[51]利用傅里葉變換近紅外漫反射光譜儀建立了煙草中多酚的近紅外模型，近紅外預測值與實測值的平均相對誤差為2.04%，說明近紅外與分光光度法的測量差異較小，可用于預測未知煙草樣品中的多酚含量，能夠快速定量測定多酚總量，方法可行性較強。
2.4其他分析檢測方法
隨著研究的深入，一些其他方法也在檢測煙草中多酚物質中得到應用。孫玉剛等[52]利用流動注射電致化學發光法測定了香煙中的綠原酸;吳靈等[53]利用分子印跡聚合物和壓電石英晶體傳感器制備出可檢測綠原酸的模擬生物傳感器，測定出煙草中綠原酸的含量;李應金等[54]采用分光光度法測定煙草中的總多酚含量，確定在540nm處檢測效果最優，并探究出影響總多酚含量測定的因素包含顯色時間及顯色溫度，通過與高錳酸鉀滴定法對比驗證此方法操作更加便捷，測定結果更為準確，成本更低;彭友元等[55]采用毛細管電泳電化學檢測法在16min內同時測定了煙草中的蘆丁、綠原酸、槲皮素和咖啡酸，該方法重現性良好，減少了預處理及預富集步驟，可實現實際樣品中多酚的測定需要。
3結語
一直以來，社會各界都在關注煙草制品的安全性問題，煙草制品的品質及安全性取決于煙草中多酚類物質的種類及含量差異，所以，國內外學者也致力于煙草中多酚類物質的提取分離與分析研究，這對煙草制品的降焦減害也具有重要意義。目前，關于提取煙草多酚的方法已有許多報道，但所提取多酚含量偏低，不利于直接應用;而針對其他干擾物質較多的情況，主要采用固相萃取技術和大孔樹脂吸附等方法進一步提高煙草多酚的純度，并將其應用到工業產品中;但要將煙草多酚更廣泛地應用于食用、藥用等領域，其純化技術，尤其可工業化的純化工藝是當前亟待研發的焦點。另外，現有檢測方法仍不能將煙草多酚全部準確檢測出，為更加全面綜合地分析煙草中的多酚物質，以實現可選擇性按需添加煙草制品中的多酚物質，增加煙草多酚的實際應用價值，還需要不斷探究前處理簡單、準確度高、能適于測定實際煙葉樣品中更多多酚的方法。——論文作者：張花1顧麗莉1黃智華2*張尉1杜康1姚雯1彭健1
SCISSCIAHCI
