發布時間：2021-06-17所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:本研究采用鄰苯二甲醛法從柏式中喙鯨(Mesoplodondensirostris)內臟中篩選出一株具高效降解膽固醇功能的乳酸菌HJ-S2，利用16SrDNA分子生物學和API50CH系統鑒定其為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。為提高乳酸菌HJ-S2體外降膽固醇能力，考察了菌株的
摘要:本研究采用鄰苯二甲醛法從柏式中喙鯨(Mesoplodondensirostris)內臟中篩選出一株具高效降解膽固醇功能的乳酸菌HJ-S2，利用16SrDNA分子生物學和API50CH系統鑒定其為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。為提高乳酸菌HJ-S2體外降膽固醇能力，考察了菌株的生長特性，并從培養基條件和發酵條件兩個方面，采用單因素和正交試驗進行工藝優化。優化后的培養基條件為:蛋白胨含量5g/L，葡萄糖含量25g/L，膽固醇含量1.0g/L，膽鹽含量2.0g/L;發酵條件為:溫度37℃，pH6，培養時間24h，接種量1%。在此優化條件下，膽固醇降解率達到69.81%，較優化前有顯著提升，為功能性益生菌制劑的開發應用提供生產工藝及參考依據。
關鍵詞:海洋生物學;植物乳桿菌;降膽固醇;喙鯨;發酵工藝優化
膽固醇在人體內具有重要的生理作用，是人體合成荷爾蒙以及組成神經細胞不可缺少的重要物質[1]，在體內可轉化成類固醇激素、VD3及膽汁酸等物質。流行病學和臨床研究表明，血清膽固醇水平和心腦血管疾病的發生呈明顯正相關性，血清膽固醇水平每高出正常水平1mmol，導致心血管疾病的風險便增加約35%[2]。營養學家推薦食物膽固醇的攝入量為每人每天250～300mg，攝入過多會使血清中的膽固醇升高，誘發冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病[3-4]。因此研究開發具有降膽固醇效果的藥品、保健品及食品已成為當前的研究熱點。
乳酸菌(LacticAcidBacteria，LAB)是指一群發酵糖類產生大量乳酸的細菌總稱，是公認的安全微生物[5]。近些年的研究表明，定殖于腸道中的有益乳酸菌群具有多種保健作用:維持微生態平衡和腸道機能、降低血清膽固醇、緩解乳糖不耐癥、改善肝功能、增強機體免疫功能及抗腫瘤等[6]。Oh等(2015)通過體外試驗發現，從傳統發酵的小米酒中分離所得乳酸菌有作為益生菌制劑用于發酵工業的潛在用途[7]。李昵等(2012)、蒲博等(2014)、丁苗等(2014)證實了乳酸菌在體內的降解膽固醇功能[8-10]。Zhang等(2016)對降低蛋黃膽固醇的復合乳酸菌劑(嗜熱鏈球菌Streptococcusthermophilus、嗜酸乳桿菌Lactobacillusacidophilus、雙歧桿菌Bifidobacterium)進行了工藝優化[11]。付永巖等(2019)優化了3株具降膽固醇能力乳酸菌的發酵培養基條件，為菌體高密度培養提供依據[12]。目前所報道的降膽固醇乳酸菌大多來自陸源，而海洋源乳酸菌則鮮有報道。
本研究對海平面300m以深海洋哺乳動物柏氏中喙鯨(Mesoplodondensirostris)內臟中的乳酸菌進行了降膽固醇活性篩選，并根據篩選所得菌株的生長特性及培養基條件、發酵條件兩個方面采用正交實驗優化各項技術參數，獲得其對降膽固醇的優化條件，為海洋源功能性益生菌制劑的開發應用提供技術參考依據。
1材料與方法
1.1樣品與試劑
樣品取自2017年10月擱淺于福建省寧德蕉城區(三都澳青山海域)的柏式中喙鯨的腸道內含物。無菌操作取樣后將樣品送至本實驗室-20℃冰箱保存備用。
蛋白胨購自生工生物工程(上海)有限公司;眎蛋白胨購自青島海博生物技術有限公司;菊糖購自阿拉丁試劑有限公司;胰蛋白胨、葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、膽固醇購自國藥集團化學試劑有限公司;鄰苯二甲醛購自麥克林試劑公司;可溶性淀粉、吐溫80購自西隴化工股份有限公司;試劑均為國產分析純。
1.2培養基
MRS培養基(1L):蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、檸檬酸氫二銨2.0g、乙酸鈉5.0g、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.2g、吐溫801.0mL、葡萄糖20g，蒸餾水定容至1L。調節pH到6.4左右，121℃滅菌20min。
MRS-CHOL培養基(1L):在上述MRS培養基礎上添加膽固醇1.0g，吐溫8020mL，牛膽鹽3.0g。將1.0g膽固醇置于20mL吐溫80中，加熱至沸騰后使其溶解，趁熱緩慢倒入培養基中，呈膠束溶液狀態，此時培養基的顏色呈不透明淡黃色。配制好的培養基在121℃滅菌20min后趁熱將試管晃動或上下顛倒振蕩，以使該膠狀物完全溶解，置于室溫中自然冷卻，放置備用。
1.3實驗方法
1.3.1菌株分離純化及降膽固醇功能的篩選將樣品混合適量無菌水研磨均勻，吸取1mL研磨液轉移至裝有含9.0mL0.9%滅菌生理鹽水的試管中，振蕩搖勻。從1×10-1到1×10-6進行梯度稀釋并吸取0.15mL研磨稀釋液涂布于MRS(含碳酸鈣)平板上，置于恒溫培養箱37℃厭氧培養36～72h。根據菌落的顏色、大小、光澤、透明程度等，挑取有透明圈的單菌落于MRS平板上進行多次劃線純化，記錄菌落形態特征。將純化菌株進行革蘭氏染色、油鏡和過氧化氫酶實驗，凡是革蘭氏染色陽性，過氧化氫酶陰性的菌株疑似為乳酸菌。純化后菌株接種于MRS斜面培養基上培養，4℃保存備用。
采用鄰苯二甲醛法[13]對待測菌進行降膽固醇能力的篩選。將疑似乳酸菌連續活化2次后，按2%接種量接種到MRS-CHOL液體培養基中，37℃厭氧培養24h后取1mL發酵菌液，離心(8000r/min)10min后取上清液采用鄰苯二甲醛法測定上清液中膽固醇含量，按公式(1)計算降膽固醇率，實驗重復3次。
式(1)中:A0、A1分別為未接菌上清液和菌株發酵上清液的膽固醇質量含量(mg/mL)。
1.3.2菌株HJ-S2的分子鑒定挑取保存于平板上2～3個菌落混合于API50CH培養基中，制得渾濁度相當于2McFarland的菌懸浮液，將此菌懸浮液依次加入API50CH試劑條的孔中，用甘油覆蓋保持厭氧環境，底盤加10mL水使其保持濕潤的氣體環境，隨后將試劑條浮于水上，37℃培養48h觀察各糖類發酵情況。結果經API-plus軟件分析發酵糖種類確定其菌屬。
采用試劑盒提取細菌DNA，并利用16SrDNA通用引物(27F，1492R)進行PCR擴增。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳得到清晰的條帶。菌株PCR產物送至上海生工有限公司測序，并將測序結果與GenBank各標準菌株序列進行BLAST比對，使用MEGA7.0軟件構建系統發育進化樹，完成乳酸菌的分子鑒定。
1.3.3菌株生長特性的測定取保存的菌種，在無菌條件下接種至MRS液體培養基中，37℃培養24h后按2%的接種量連續活化兩次，得乳酸菌菌懸液。將活化后的菌株HJ-S2按2%接種量接入500mLMRS液體培養基中，37℃搖床培養。測定初始培養基的OD600，前期10h每間隔1h測定培養液的OD600和pH值，后期每間隔3h測定培養液的OD600和pH值，連續測定48h，繪制菌株HJ-S2的生長曲線及pH值變化。
1.3.4培養基條件對膽固醇降解率的影響分別用胰蛋白胨、大豆蛋白胨、眎蛋白胨以等量代替MRS-CHOL培養基的蛋白胨，將菌株HJ-S2按2%接種量接種于含不同氮源的MRS-CHOL培養基中，于37℃恒溫搖床培養24h，按“1.2.1”的方法測定不同種類氮源對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響。選出確定的氮源后，進一步考察氮源添加量對降解率的影響。
分別用蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖、菊糖代替MRS-CHOL培養基中的葡萄糖，測量方法同上，考察不同碳源及添加量對降解率的影響。
將菌株HJ-S2按2%接種量接種于含膽固醇含量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mg/mL的MRS-CHOL培養基中，37℃搖床培養24h，測定不同膽固醇含量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響。
將菌株HJ-S2按2%接種量接種于含牛膽鹽含量分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL的MRSCHOL培養基中，37℃搖床培養24h，測定不同牛膽鹽含量對HJ-S2膽固醇降解率的影響。
1.3.5不同發酵條件對膽固醇降解率的影響
以“1.3.4”實驗中所確定的MRS-CHOL培養基的各成分含量，將活化后的菌株HJ-S2按2%接種量接種于MRS-CHOL培養基中，37℃恒溫搖床培養54h，每6h取培養液，測定不同培養時間對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響。
菌株HJ-S2活化后按2%接種量接種于MRSCHOL培養基中，分別于37℃、38℃、40℃、41℃、42℃恒溫搖床培養24h，測定不同培養溫度對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響。
菌株HJ-S2接種于初始pH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10的MRS-CHOL培養基中，37℃恒溫搖床培養24h，測定不同初始pH對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響。
菌株HJ-S2按1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量接種于MRS-CHOL培養基中，37℃恒溫搖床培養24h，測定不同接種量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響。
1.3.6培養基、發酵條件正交試驗為了確定最佳的液體培養基配方，依據前期單因素條件對菌株HJ-S2膽固醇降解率影響的實驗結果以及細菌生長所需營養要素的基本原則，以膽固醇降解率為指標，分別設計葡萄糖、蛋白胨、膽固醇、膽鹽含量4因素3水平正交試驗及pH、培養時間和接種量3因素3水平正交試驗。
1.4數據統計分析
采用Excel2013軟件分析數據，每個試驗重復3次;采用統計學軟件SPSS19.0軟件進行差異顯著性分析，當p<0.05時，差異被認為是有意義的，結果表示為平均值±標準差;采用Origin8.0和Excel2013進行繪圖。
2結果與討論
2.1乳酸菌的分離純化及降膽固醇功能篩選
從喙鯨內臟共分離純化出30個單菌落，生理生化實驗及形態學觀察結果顯示，該30株菌為革蘭氏陽性菌，菌落形態為透明、白色或黃色且邊緣規則，油鏡下觀察菌體形態為球狀或桿狀，過氧化氫酶試驗為陰性，符合乳酸菌屬的特征。將所得乳酸菌進行降膽固醇能力篩選實驗，其中降解率小于10%的有6株菌，10%～20%的有8株菌，>20%～30%的有8株菌，>30%～40%的有5株菌，40%以上的有3株菌(HJ-W33、HJ-W64、HJ-S2)，降解率分別為40.69%、40.78%、48.82%，其中HJ-S2(CGMCCNo:17720)的降解率最高為48.82%，具有較高的潛在研究價值(表1)。
2.2具降膽固醇功能乳酸菌的鑒定
對菌株HJ-S2進行API50CH碳水化合物發酵鑒定，將發酵結果(表2)輸入API數據庫進行比對分析，鑒定其為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，后續為了使鑒定結果更精準，結合16SrDNA序列分析進行分子水平的鑒定。
菌株HJ-S2的PCR產物大小為1.5kb左右，符合16SrDNA序列長度。將擴增后的PCR產物測序結果與已知標準菌株序列進行同源性對比，BLAST結果顯示該菌株的序列與登錄號為LC379973.1、CP0237771.1以及MH779888.1等植物乳桿菌的16SrDNA基因組序列相似性均為100%，證實了菌株HJ-S2為植物乳桿菌L.plantarum(GenBank登錄號MK248728)。使用MEGA7.0軟件構建了其系統發育樹，如圖1所示。
2.3菌株的生長特性菌株
HJ-S2的生長特性如圖2所示。前期0～3h是生長延滯期，該階段菌株適應培養環境，繁殖緩慢，數量增長較少，OD600由0.25緩慢上升至0.38，pH值從初始培養基的6.10下降至5.63。3～24h是菌株生長對數期，該階段細菌代謝和繁殖快速增長，生長迅速，細菌數呈對數式生長，OD600由0.38迅速上升至1.65，pH值迅速從5.63下降至3.72左右。24～34h為菌株生長的穩定期，其間活菌數達到最大值且基本保持不變，菌體代謝和繁殖平衡，代謝產物持續積累，OD600維持在1.65左右，此時酸性代謝產物趨于穩定，體系pH值穩定在3.70左右。34～48h是菌株的衰亡期，該階段活菌數略有降低，部分菌株衰老死亡，且菌株活性降低并趨于停滯，OD600從1.65降至1.50左右且具持續緩慢降低的趨勢，菌體的凋亡使部分酸性代謝產物減少，pH值略有回升，從3.70回升至3.90左右。由此可見，菌株HJ-S2生長速率較快且產酸能力強，適合發酵法制備功能性微生態制劑。
2.4不同氮源和碳源對膽固醇降解率的影響
考察不同氮源對膽固醇降解率的影響結果如圖3(a)所示。同一菌株在含不同氮源的MRS-CHOL培養基中膽固醇降解率差異顯著(p<0.05)。菌株HJ-S2在以蛋白胨為氮源的培養基中膽固醇降解率最高，胰蛋白胨略低，眎蛋白胨較低，大豆蛋白胨最低。此外，蛋白胨價格也相對較低，綜合考慮選擇蛋白胨作為發酵氮源。進一步對考察不同蛋白胨添加量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響，結果如圖3(b)所示，氮源含量對菌株的膽固醇降解率有一定影響。當蛋白胨含量為10g/L，降解率最高，達到39.28%;當繼續提高蛋白胨的添加量，降解率有所下降，維持在25.80%左右，由此確定正交試驗水平為蛋白胨含量5、10、15g/L。
考察不同碳源對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響結果如圖3(a)所示。菌株在含不同碳源的MRS-CHOL培養基中膽固醇降解率差異顯著(p<0.05)。菌株HJ-S2在以葡萄糖為碳源的培養基中膽固醇降解率最高，乳糖、麥芽糖、菊糖次之，而可溶性淀粉作為碳源時降解率最低。葡萄糖作為單糖，微生物能很好地直接吸收利用，因此選擇葡萄糖作為發酵碳源。
進一步考察葡萄糖不同添加量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響，結果圖3(b)所示。當葡萄糖添加量為20g/L時，菌株HJ-S2對膽固醇的降解率最高，達到42.13%，當繼續提高葡萄糖的添加量，降解率反而下降維持在29.30%左右。因為碳源含量過高使菌體生長過快，過早衰老發生自溶，從而影響菌體對膽固醇的吸收[14]。由此確定正交試驗中葡萄糖含量為15、20、25g/L。
2.5膽固醇、膽鹽含量對膽固醇降解率的影響
不同膽固醇含量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響如圖4(a)所示。菌株HJ-S2對膽固醇的降解率隨膽固醇含量的升高先增大后減少，當膽固醇含量為1.0g/L時，降解率達到最大值為38.94%，隨著膽固醇含量的增加，降解率略有降低，后續維持在26.13%左右。由此確定正交試驗中膽固醇含量為0.5、1.0、1.5g/L。
不同膽鹽含量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響如圖4(b)所示。菌株HJ-S2對膽固醇的降解率隨膽鹽含量升高先增大后減少，膽鹽含量為1.0g/L時，膽固醇降解率較低為18.62%;當膽鹽含量為2.0g/L時，降解率達到最大值為43.99%;膽鹽含量達到3.0g/L時，膽固醇降解率達到了38.62%左右，隨著膽鹽含量的升高，膽固醇降解率也相應減小后續維持在37.51%左右。由此確定正交試驗中膽鹽含量為1.5、2.0、2.5g/L。
2.6發酵時間、培養溫度對膽固醇降解率的影響
發酵時間對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響如圖4(c)所示，結合菌株生長曲線進行分析，0～3h為菌株的生長延滯期，菌體適應培養環境，繁殖緩慢，數量增長較少，此階段膽固醇降解率較低;3～24h為菌株的對數生長期，此階段細菌數量呈指數增長，細菌代謝繁殖快速增長，培養基中膽固醇含量急劇下降，當培養到24h時，膽固醇降解率達到最大42.18%;24～34h為乳酸菌生長的穩定期，膽固醇降低率不再增加且略有下降;34～54h為菌株的衰亡期，部分菌體衰老死亡，膽固醇降低率逐漸穩定在32.15%左右。
不同培養溫度對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響，結果如圖4(d)所示。不同培養溫度對菌株的降膽固醇能力有一定影響，當培養溫度為34℃時，膽固醇降解率最低為25.82%左右;當溫度為37℃時，菌株HJ-S2對膽固醇降解率最高達41.39%且與38℃時的降解率相差不大;溫度達到40℃以上時，使菌體活性相應降低，影響菌體對膽固醇的吸收從而使膽固醇降解率稍有降低。因此后續實驗一直在37℃進行分離培養，且菌體的最適溫度為37℃，溫度過低或過高都會影響菌體的生物活性。——論文作者：萬婧倞，羅曼，吳鵬，黃仕新，唐旭*，徐長安
相關期刊推薦：《應用海洋學學報》(季刊)創刊于1982年，由國家海洋局第三海洋研究所、中國海洋學會、福建省海洋學會主辦。本刊為全國性海洋科學學術期刊。主要刊載臺灣海峽及其鄰區海域(東海、南海)的物理海洋學、海洋化學、海洋環境學、海洋生物與水產學、海洋地質與地震學、海洋開發與管理等方面的學術論文和研究報告等。讀者對象主要是國內外海洋生物、水產、化學、環保、水文、氣象、港工、地質、地震等單位和部門的科技人員、管理人員、高等院校相應專業的師生等。
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