發布時間：2021-05-24所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： [摘要]目的：探究白細胞介素(IL)-17在牙髓炎癥過程中時空表達，研究IL-17對牙髓炎可能的調節機制。方法：構建大鼠牙髓炎模型，蘇木精-伊紅(HE)染色觀察牙髓組織結構形態，免疫組織化學染色檢測牙髓中IL-17表達;培養人牙髓細胞，腫瘤細胞壞死因子(TNF)-刺激模
[摘要]目的：探究白細胞介素(IL)-17在牙髓炎癥過程中時空表達，研究IL-17對牙髓炎可能的調節機制。方法：構建大鼠牙髓炎模型，蘇木精-伊紅(HE)染色觀察牙髓組織結構形態，免疫組織化學染色檢測牙髓中IL-17表達;培養人牙髓細胞，腫瘤細胞壞死因子(TNF)-α刺激模擬炎癥狀態，RT-qPCR檢測IL-17基因表達，ELISA檢測IL-17的蛋白表達;IL-17重組蛋白刺激牙髓細胞，RT-qPCR檢測MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-13的表達，膠原酶譜和明膠酶譜檢測MMP-1和MMP-2酶活性;Westernblot檢測信號通路表達。結果：IL-17在牙髓炎癥過程中持續高表達，體外TNF-α刺激可升高牙髓細胞IL-17的表達。IL-17刺激牙髓細胞，上調MMP-1和MMP-2的酶活性，并激活絲裂原蛋白激酶(MAPK)信號通路。結論：IL-17在炎癥牙髓表達上調，并可通過升高MMP-1和MMP-2的表達，激活MAPK信號通路發揮促炎作用。
[關鍵詞]牙髓炎;白細胞介素-17;基質金屬蛋白酶;免疫學
牙髓炎是口腔臨床常見病。齲病、隱裂和牙體折裂等導致的細菌感染牙髓均可引起牙髓炎。急性牙髓炎發作可致使劇烈疼痛，如未能及時治療，可進一步發展為牙髓壞死和根尖周炎，嚴重時甚至危及生命[1]。牙髓炎癥中，侵入的細菌及其代謝產物可以刺激牙髓中的免疫細胞與非免疫細胞產生大量炎性因子和趨化因子。這些因子與多種細胞相互作用形成一系列復雜的調控網絡[2]。
白細胞介素(interleukin，IL)家族在炎癥和多種感染性疾病中起到重要作用，其中IL-17在近期的研究中受到廣泛關注。IL-17在多種感染性疾病中高表達，具有抗感染和促炎的雙重作用[3]，同時在自身免疫性疾病中也是關鍵的促炎因子[4]。IL-17不僅參與了全身炎性疾病，而且在牙周炎、牙髓炎、根尖周炎，以及扁平苔蘚等口腔疾病中也發揮炎癥調節的作用[5-8]。盡管已有研究提示IL-17在牙髓炎中高表達[8]，但是目前對IL-17在牙髓炎癥中的作用機制還缺乏深入研究。
基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)與細胞外基質的降解和改建密切相關，并協 白細胞介素(interleukin，IL)家族在炎癥和多種感染性疾病中起到重要作用，其中IL-17在近期的研究中受到廣泛關注。IL-17在多種感染性疾病中高表達，具有抗感染和促炎的雙重作用[3]，同時在自身免疫性疾病中也是關鍵的促炎因子[4]。IL-17不僅參與了全身炎性疾病，而且在牙周炎、牙髓炎、根尖周炎，以及扁平苔蘚等口腔疾病中也發揮炎癥調節的作用[5-8]。盡管已有研究提示IL-17在牙髓炎中高表達[8]，但是目前對IL-17在牙髓炎癥中的作用機制還缺乏深入研究。
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同多種促炎因子和趨化因子調節炎癥和免疫反應[9]。牙髓炎常常伴有牙髓組織降解和破壞，然而目前尚缺乏研究探索牙髓炎癥中IL-17與MMP之間的聯系，因此在本研究中主要研究IL-17在牙髓炎癥中的表達和對MMP的作用，并探索IL-17促進炎癥的可能機制。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1細胞來源牙髓細胞由年齡為18～22歲，因正畸需要拔除的完整正前磨牙或第三恒磨牙，無菌條件下獲取其中牙髓細胞進行體外原代培養獲得。所有操作均經患者知情同意。
1.1.2試劑鼠尾膠原及明膠(Sigma，美國);重組人IL-17蛋白(R&D，美國);IL-17ELISA檢測試劑盒(Cloudclone，美國);兔抗人p65抗體(CST，美國);兔抗人磷酸化p65抗體(CST，美國);兔抗人p38抗體(CST，美國);兔抗人磷酸化p38抗體(CST，美國);兔抗人Erk抗體(CST，美國);兔抗人磷酸化Erk抗體(CST，美國);兔抗人α-tubulin抗體(Abcam，美國);磷酸鹽緩沖液(中杉金橋，中國);高糖DMEM培養基(Corning，美國);胎牛血清(Gibco，美國);cocktail蛋白酶抑制劑(Roche，中國);TEMED、BSA、DMSO(Sigma，美國)。
1.2方法
1.2.1牙髓細胞的獲取和原代培養無菌條件下劈冠獲取牙髓細胞。在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。其后根據需要進行傳代，并在使用第3～5代的牙髓細胞進行相關實驗。
1.2.2大鼠牙髓炎模型的建立按照文獻[8]方法建立大鼠牙髓炎動物模型：6周齡SD大鼠18只。根據體重行10%水合氯醛腹腔麻醉，渦輪機右側下頜第一磨牙行開髓，暴露髓腔;并以自身未開髓牙做自身對照。分別在術后1、3和5d，脫頸處死并收集大鼠下頜骨，4%多聚甲醛固定，其后10%EDTA脫鈣液脫鈣。完全脫鈣后脫水、浸蠟、石蠟包埋。
1.2.3石蠟切片蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化組織切片;蘇木精染色3min，流水沖洗，鹽酸乙醇分色，氨水返藍;0.5%伊紅液染色5min，蒸餾水沖洗;梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。
1.2.4免疫組織化學染色二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化組織切片;抗原修復液95℃水浴恒溫修復40min;按照R&D免疫組化試劑盒說明依次進行抗原封閉;其后滴加一抗工作液[腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)，1∶100;IL-17，1∶800]，4℃過夜;次日復溫后，PBS搖床清洗;依次孵育二抗和HRP;DAB顯色。蘇木精復染，氨水返藍，鹽酸酒精分色;脫水、封片。
1.2.5RNA提取、逆轉錄和實時熒光定量PCR(re-altimequantitativePCR，RT-qPCR)牙髓細胞中的RNA提取采用TRIzloTM(Ambion，LifeTech-nologies，USA)萃取法按照廠家說明提取。隨后，cDNA的逆轉錄使用RT逆轉錄試劑盒(TaKaRaBiotechnology，China)進行。最終使用SsoAd-vancedTMSYBR?GreenSupermix熒光染料進行RT-qPCR反應。引物序列如下：IL-17，F：5′-CTA-CAACCGATCCACCTCACC-3′;R：5′-AGC-CCACGGACACCAGTATC-3′。GAPDH，F：5′-TCAACAGCGACACCCACTC-3′;R：5′-GCTG-TAGCCAAATTCGTTGTC-3′。MMP-1，F：5’-TGGTGTTGCCTGCTGCCTTC-3’，R：5’-TCATCTGCACAGCTCTGGC-3’;MMP-2，F：5’-ATGCAGTGGGGGCTTAAGAA-3’;R：5’-TCT-GGGGCAGTCCAAAGAAC-3’。MMP-13，F：5’-GCACTTCCCACAGTGCCTAT-3’;R：5’-AGT-TCTTCCCTTGATGGCCG-3’。其中，以GAPDH作為內參。反應條件如下：95℃預變性10s1個循環，95℃5s和60℃30s40個循環。mRNA的相對濃度采用2-△△Ct法計算。
1.2.6蛋白提取、蛋白濃度測定及Westernblot收集細胞，使用蛋白裂解液(ThermoFisherScien-tific，Hudson，NH)按照說明進行裂解，提取蛋白。使用BCA檢測試劑盒測定蛋白濃度(碧云天，中國)。將蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液混合，水浴變性。點樣進行電泳，至溴酚蘭跑出玻板后終止電泳。恒流250mA，轉膜60min。5%脫脂奶粉封閉1h;一抗(GAPDH1∶5000，信號通路各抗體濃度均為1∶1000)，4℃孵育過夜;洗膜，加入山羊抗兔二抗(1∶5000)，室溫孵育1h，洗膜;加顯影液顯影，BIO-RAD化學發光成像系統中成像并分析結果。
1.2.7膠原酶譜和明膠酶譜檢測MMP-1和MMP-2酶活性。體外培養人牙髓細胞，當融合度達到70%～80%時，實驗組加入重組TNF-α蛋白(10ng/mL)，對照組加入等體積PBS，處理48h后收集培養基。高速離心，取上清與樣本緩沖液混合。將混合的液體在10%的丙烯氨凝膠中進行電泳(明膠中含有1%明膠，膠原酶譜中含有1%鼠尾膠原)。電泳完成后將凝膠置于孵育緩沖液中，37℃孵育基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)與細胞外基質的降解和改建密切相關，并協48h，其后使用考馬斯亮藍染色。明膠酶譜用來檢測MMP-2的活性，膠原酶譜用來檢測MMP-1的活性。
1.2.8ELISA檢測IL-17蛋白表達體外培養人牙髓細胞，加入重組TNF-α(10ng/mL)處理48h，并以空培養基培養48h作為空白對照，其后收集細胞培養基上清。ELISA法檢測兩組細胞IL-17表達。
2結果
2.1IL-17在牙髓炎癥過程中的時空表達HE染色結果顯示牙髓形態和炎癥狀況：正常牙髓組織被牙本質包繞，緊靠牙本質的成牙本質細胞層，內側依次為乏細胞層，富細胞層和中央區，層次分明;而在炎癥牙髓中，開髓孔下方的炎癥區域有大量炎細胞浸潤，并有擴張充血的血管。隨著牙髓炎癥的發展，牙髓組織破壞增多，炎癥從冠髓發展到根髓(圖1～圖3)。
免疫組織化學染色結果發現，在炎癥牙髓組織中，大量炎性細胞浸潤的區域有TNF-α高表達，提示該處發生明顯炎癥，并且在同一區域IL-17的表達增強，而在正常牙髓中IL-17表達不顯著(圖1～圖3)。牙髓炎癥1、3和5d的標本免疫組織化學染色結果顯示，IL-17在牙髓炎癥的發展過程中持續于炎性細胞浸潤局部高表達。上述結果提示，在牙髓炎過程中局部IL-17始終高表達，IL-17參與了牙髓炎的發生發展。
2.2體外模擬炎癥介導牙髓細胞中IL-17表達體內實驗結果提示IL-17在炎癥牙髓中有高表達。為進一步探究IL-17在牙髓炎中的作用和功能，體外使用重組TNF-α蛋白刺激牙髓細胞，模擬牙髓炎癥。RT-qPCR檢測IL-17基因水平表達的變化，ELISA檢測IL-17的蛋白表達改變。結果表明，IL-17mR-NA表達水平在TNF-α刺激后1h(3444.00±37.50)顯著高于對照組(1.01±0.04)，P<0.001。蛋白表達水平在TNF-α處理后24h[(31.85±3.65)pg/mL]相較于對照組[(5.74±1.60)pg/mL，P<0.05]也明顯上調。結果說明，TNF-α模擬炎癥刺激可以介導牙髓細胞產生IL-17，牙髓細胞可通過產生IL-17參與了牙髓免疫的過程。
2.3IL-17對牙髓細胞中MMP-1和MMP-2表達的影響文獻表明IL-17可以刺激多種炎性因子和趨化因子的表達，具有促炎作用[3]。MMP是牙髓炎癥中促使牙髓組織水解破壞的重要因子，目前對IL-17在牙髓炎癥中與MMPs的聯系尚缺乏研究。為了進一步探究IL-17在牙髓炎癥過程中的作用，體外使用人重組IL-17蛋白(10ng/mL)刺激人牙髓細胞4h，通過RT-qPCR檢測的MMP-1和MMP-2的基因表達水平變化。MMP-1的表達在IL-17蛋白刺激的牙髓細胞中(4.48±0.69)較對照組細胞(1.01±0.03，P<0.001)，有顯著提高，同樣，IL-17刺激下MMP-2的基因表達水平(1.57±0.29)相比對照組(1.00±0.02，P<0.001)，也有上調。明膠酶譜和膠原酶譜分別檢測IL-17刺激人牙髓細胞后MMP-1和MMP-2在酶活性改變情況，結果表明牙髓細胞在受到IL-17刺激后MMP-1和MMP-2的酶活性顯著上調(圖4)。這說明牙髓炎癥反應中，IL-17可以刺激牙髓細胞MMP-1和MMP-2酶活性增強，MMP-1和MMP-2酶活性升高可進一步導致炎癥中細胞外基質的降解。
2.4IL-17可通過激活絲裂原蛋白激酶(MAPK)信號通路介導牙髓炎癥NF-κB以及MAPK通路是炎癥過程中的重要細胞通路，為了進一步了解IL-17對牙髓炎癥的調控機制，檢測了正常牙髓細胞以及IL-17刺激下牙髓細胞中的NF-κB以及MAPK信號通路的活化狀況。結果顯示IL-17刺激牙髓細胞后，MAPK(p38)通路在30min時被活化，磷酸化水平上調(圖5)。這表明IL-17對牙髓炎癥反應的調節作用可通過MAPK(p38)通路實現。
3討論
IL-17高表達于多種炎性疾病和自身免疫性疾病[3，4，10]，發揮促炎癥破壞和抗感染的雙重作用。隨著研究深入，近期對其在口腔相關疾病中的作用也得到了揭示。多篇文獻提示IL-17在根尖周炎和牙周炎中高表達，并且介導了炎癥的發生和骨的破壞[11，12]。2014年的一項研究報道IL-17在炎癥牙髓中呈明顯高表達[13]，并能夠引起牙髓細胞產生IL-6和IL-8兩種重要的炎性因子，但是在這項研究中缺少體內實驗和蛋白表達的結果支持。在本實驗中，通過構建的大鼠牙髓炎模型并進行免疫組織化學染色，發現IL-17在炎癥牙髓中表達明顯上調，這從體內和蛋白表達水平上印證了之前對于IL-17在牙髓炎中相關研究結果。并且通過多個時間點的檢測，發現IL-17在牙髓炎癥發展過程中持續高表達，說明IL-17在牙髓炎進程中持續發揮作用。
IL-17不僅可以由Th17細胞、巨噬細胞，肥大細胞等多種免疫細胞產生，而且可以由部分非免疫細胞產生[14-16]。牙髓細胞作為一種成纖維細胞，是牙髓的主要構成細胞。本研究使用經典炎性細胞因子TNF-α[17]刺激人牙髓細胞模擬炎癥反應，在基因水平和蛋白水平上均能導致IL-17表達升高。牙髓細胞作為一種非免疫細胞，在牙髓炎癥中可通過產生IL-17達到促炎或抗感染的作用，從而參與牙髓免疫的過程。
�、裥秃廷笮湍z原是牙髓組織中最為主要的膠原成分，并且其中Ⅰ型膠原被認為與牙髓損傷修復密切相關[18]。在本研究中，IL-17的刺激可以導致牙髓細胞MMP-1和MMP-2基因表達和酶活性上調。MMP-1活性上調可能會導致牙髓Ⅰ型膠原降解增多，而MMP-2活性上調會導致牙髓中變性膠原的明膠的降解增多[19]。因此，IL-17通過介導MMP-1和MMP-2的酶活性增強，發揮促進炎癥和牙髓壞死崩解的作用。MAPK通路是促炎細胞間信號級聯的重要通路[20]，并參與調控包括細胞功能、基因表達、分化、凋亡等多種生物學過程。在本研究中發現IL-17刺激牙髓細胞可以激活MAPK通路。這提示IL-17的促炎作用可能是通過MAPK通路實現的。
綜上所述，在本實驗中發現在牙髓炎癥過程中IL-17表達升高，高表達的IL-17可以通過介導MMP-1和MMP-2的酶活性上調發揮促炎作用。——論文作者：劉夢余
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