基于細胞生物電傳感效應的復方丹參片溶出動力學研究

發布時間：2022-03-24所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次

摘 要： 摘 要：目的 建立復方丹參片的細胞生物電傳感效應模型，以此進行復方丹參片的溶出動力學研究。方法 以實時細胞電子分析技術(real-time cell-based assay，RTCA)為手段，測定復方丹參片的體外溶出度，建立溶出動力學模型，并與紫外分光光度法進行比較驗證。結果 CCK-8

　　摘 要：目的 建立復方丹參片的細胞生物電傳感效應模型，以此進行復方丹參片的溶出動力學研究。方法 以實時細胞電子分析技術(real-time cell-based assay，RTCA)為手段，測定復方丹參片的體外溶出度，建立溶出動力學模型，并與紫外分光光度法進行比較驗證。結果 CCK-8 實驗和 RTCA 實驗聯合篩選出對復方丹參片有特定依賴性的細胞株，建立基于 RTCA 技術的復方丹參片溶出動力學模型，得到最佳擬合模型 Weibull 模型 ln{ln[1/(1-Q)]}=1.071 4 lnt-3.736 7;建立基于紫外分光光度法的復方丹參片溶出動力學模型，得到最佳擬合模型 Weibull 模型 ln{ln[1/(1-Q)]}=1.080 4 lnt-3.723 4;兩者的 Weibull 模型比較，RTCA 擬合的模型效果更佳。結論 RTCA 技術應用于中藥復方固體制劑溶出動力學研究，具有可行性，并為中藥及中藥復方質量評價提供了新思路。

　　關鍵詞：復方丹參片;體外溶出度;實時細胞電子分析技術;溶出動力學模型;CCK-8 實驗;Weibull 模型

　　中國傳統醫藥學十分重視人體氣、血、津液的正常運行，認為血瘀證是由氣虛、氣滯、火熱、寒凝等引起，血停滯不行而血行不暢。祛瘀活血法是治療血瘀證的基本方法，在古代經典著作《傷寒論》《金匱要略》等中均有活血化瘀法的記載，活血化瘀通過多種活血化瘀藥物的綜合，具有化瘀行滯的作用，通過平衡氣血、調節陰陽與疏通活血等多重作用，幫助患者扶正祛邪，淤血消除，疼痛自然消失[1]�，F代臨床研究[2-5]顯示，活血化瘀中藥及其復方在改善血流動力學、抑制血栓形成、降低血壓、抑制腫瘤疾病上有顯著的臨床療效。隨著活血化瘀中藥及其復方作用機制不斷深入研究，證明活血化瘀類中藥對改善臨床血瘀證具有積極意義，展現出良好的應用前景。復方丹參片作為最為常用的活血化瘀類中成藥之一，由丹參、三七、冰片組成，對冠心病、心絞痛以及氣滯血瘀所致的胸痹、胸悶等疾病[6]，有確切且顯著的療效，被廣泛應用于臨床。復方丹參片由于其藥效物質成分較復雜，仍有許多療效不明的未知成分[7-10]，目前所測的化學指標成分往往與其活血化瘀功效不是直接相關，傳統的以單一化學指標成分為中心的質量評價方法已不適用，使其質量評價受到限制，亟需能夠體現整體藥效的新型質量評價與分析方法的建立。

　　本實驗采用了一種新型的電子分析技術實時細胞電子分析技術(RTCA)。RTCA 是一種基于阻抗的瞬態電池-電感應連續記錄系統，通過監測細胞的動態變化過程(包括細胞增殖與分化、凋亡與衰老、黏附等多種細胞生理狀態)，轉換成電信號細胞指數(cell index，CI)，并形成時間劑量依賴性細胞反應曲線(TCRPs)，間接反映藥物對細胞作用(促進或抑制)的強弱，并可據此評價藥物的生物活性[11]。本實驗將 RTCA 應用于復方丹參片血瘀功能相關的細胞生物活性的檢測，嘗試篩選出對藥物反應靈敏、穩定且有特定濃度依賴性的細胞株，探索其用于質量評價的可能性。

　　1 材料

　　1.1 實驗動物

　　健康成年 SD 大鼠，雄性，體質量 200～240 g，購于南京青龍山動物養殖場，動物許可證號 SYXK (蘇)2017-0001。

　　1.2 主要試劑與儀器

　　CCK-8 溶液(日本同仁化學研究所);青鏈霉素(Gibco 公司);胎牛血清(FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS，Gibco 公司)、胰蛋白酶溶液(Gibco 公司);水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司，分析純);RTCA 板(杭州艾森生物有限公司);DMEM 培養基(Corning 公司);復方丹參片(廣西藥用植物園制藥廠，批號 171101-049);大鼠心肌細胞(H9C2 細胞)、人臍靜脈內皮細胞(HUVEC 細胞)購自中國科學院上海細胞庫，大鼠胸主動脈平滑肌細胞(RA-VSMC 細胞)來自大鼠原代分離。

　　RC-3 溶出度測試儀(天津新天光公司); UV-2401 紫外可見分光光度計(日本島津公司); HH-4 數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司); RTCA 實時無標記細胞分析儀(杭州艾森生物有限公司);Sorvall ST16R 臺式高速冷凍離心機、Sorvall ST16R 臺式低速離心機(美國 Thermo 公司);3111 型 CO2 培養箱(美國 Thermo 公司);渦旋振蕩儀(美國 Bio-Rad 公司);ECLIPSE Ti-S 型倒置顯微鏡(日本 Nikon 公司);1300 SERIES A2 生物安全柜(美國 Thermo 公司)。

　　2 方法與結果

　　2.1 CCK-8 法篩選復方丹參片作用細胞的合適質量濃度

　　2.1.1 HUVEC 或 H9C2 細胞的培養 將復蘇的 HUVEC 或 H9C2 細胞置于飽和濕度的細胞培養箱中，用含 10% FBS 的 DMEM 培養基，在 37 ℃、 5% CO2 條件下培養細胞至 85%融合度時，用 0.25% 胰蛋白酶消化傳代，倒置顯微鏡中觀察，取對數生長期的細胞用于細胞實驗。

　　2.1.2 RA-VSMC 細胞的制備及培養 取體質量約 220 g SD 大鼠，ip 10%水合氯醛溶液(35 mL/kg)，待大鼠麻醉后處死，迅速剪開胸腔并剪取大鼠胸主動脈組織，立即放入預冷的含 PBS 的 DMEM 培養基(含 1×105 U/L 青鏈霉素)，并反復不斷洗滌。用手術鑷輕輕刮去血管外膜及血管內膜，將血管剪成 1 mm3 左右的小塊，分別均勻平鋪于培養皿中，向培養皿中加入含 20% FBS 的培養液 3～5 mL，置于 37 ℃、5% CO2 的飽和濕度細胞培養箱中培養，直至傳代，取對數生長期的細胞用于細胞實驗。

　　2.1.3 復方丹參片供試樣品的制備 取復方丹參片適量，置于研缽內搗碎，取 0.32 g，精密稱定，置于 50 mL 量瓶內，加入適量 pH 6.8 的 PBS 溶液，超聲 30 min 溶解，再加入 pH 6.8 的 PBS 溶液定容至刻度，濾過不溶物質(輔料的殘渣)，4 ℃儲存備用。取上述溶液稀釋不同倍數配成 0、1.0、1.25、 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、6.4 mg/mL 的藥液用于 CCK-8 實驗。

　　2.1.4 細胞種板及給藥 取正常培養的處于對數生長期的細胞，1 000 r/min 離心 5 min，計數板下計數，調整細胞密度為 2×104個/mL，鋪 96 孔板，每孔均加入 100 μL 細胞懸液，貼壁培養過夜后，加入不同質量濃度(1.0、1.25、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、 6.4 mg/mL)的復方丹參片供試樣品，48 h 后每孔加入 10 μL 的 CCK-8 檢測液，設置對照孔，37 ℃避光孵育 60 min，在波長 450 nm 測定吸光度(A)值，計算細胞存活率(細胞存活率=A 實驗/A 對照)。CCK-8 檢測結果見圖 1、2，HUVEC 和 H9C2 細胞在復方丹參片 1.0～6.4 mg/mL 反應靈敏，細胞存活率由高降到最低，可作為這 2 種細胞篩選的質量濃度范圍，因此選擇 0、0.3、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6 mg/mL 這 8 個質量濃度。由圖 2 可知，RA-VSMC 細胞在復方丹參片1.0～2.5 mg/mL時細胞存活率一直處于穩定水平，未顯示差異，而在復方丹參片 4.0～6.4 mg/mL 時，細胞存活率下降幅度較大。為了更清楚地觀察該細胞在復方丹參片不同質量濃度下的作用，需要拉大低質量濃度的間隔，縮小高質量濃度的間隔，因此選擇 0、0.5、1、2、4、4.5、5、6 mg/mL 這 8 個質量濃度。

　　2.2 RTCA 篩選復方丹參片的特定依賴性細胞株

　　2.2.1 RTCA 實驗細胞培養 各細胞培養方法同 “2.1.1”和“2.1.2”項。

　　2.2.2 復方丹參片 RTCA 實驗樣品的制備 取復方丹參片適量，置于研缽內搗碎，取 0.32 g，精密稱定，置于 50 mL 量瓶內，加入適量 pH 6.8 的 PBS 溶液，超聲 30 min 溶解，再加入 pH 6.8 的 PBS 溶液定容至刻度，濾過不溶物質，4 ℃儲存備用。取上述溶液稀釋不同倍數配成 0.3、0.6、1.0、1.4、1.8、 2.2、2.6 mg/mL 的藥液用于 HUVEC 細胞和 H9C2 細胞實驗，另取上述溶液稀釋不同倍數配成 0.5、 1.0、2.0、4.0、4.5、5.0、6.0 mg/mL 的藥液用于 RA-VSMC 細胞實驗。

　　2.2.3 RTCA測定 依據復方丹參片的藥理作用[12-14]，本實驗選取 HUVEC、H9C2、RA-VSMC 細胞，采用 RTCA 技術，測定 CI 值，測定各個樣本的 TCRPs 曲線，通過直觀判斷和統計分析，考察細胞對藥物效應反應的靈敏度、穩定性及濃度梯度依賴性。首先在細胞檢測板中每個小孔加入 50 μL 生長介質，再加入密度為 2×104 個/mL 的特定細胞懸液 100 μL。將此細胞檢測板在室溫下放置 30 min 后，放到培養箱中連續培養。24 h 后，當細胞數量穩定時，取 HUVEC 細胞和 H9C2 細胞的細胞檢測板，除對照組外，向每孔中加入配好的復方丹參片供試藥液 50 μL，使小孔內的藥液終質量濃度分別為 0.3、0.6、 1.0、1.4、1.8、2.2、2.6 mg/mL，每個質量濃度設 3 個復孔。另取 RA-VSMC 細胞的細胞檢測板，除對照組外，向每個孔中分別加入終質量濃度 0.5、1.0、 2.0、4.0、4.5、5.0、6.0 mg/mL 的復方丹參片供試樣品 50 μL，每個質量濃度設 3 個復孔。將加好樣的檢測板放入實時細胞電子分析儀中，檢測 72 h，測出各藥液作用于細胞后所產生的 TCRPs 曲線，篩選出對復方丹參片具有較好濃度依賴性響應的細胞株(即在一定時間內不同質量濃度藥物的 TCRPs 曲線明顯分開)。結果見圖 3 和 4。

　　由圖 3 可以看出，HUVEC 細胞對不同質量濃度的復方丹參片反應較靈敏，給藥后 CI 值有明顯波動。給藥初期，低質量濃度樣品組及對照組促進 CI 值的增加，在一段時間后趨向平穩。CI 值在高質量濃度樣品組作用下先快速增加，隨即大幅度減少， 2.6 mg/mL 樣品作用強烈，其 40 h 后 CI 值趨近于 0。給藥后期，與對照組相比較，低質量濃度樣品組對 CI 值起促進作用，高質量濃度樣品組對 CI 值起抑制作用。但是，后期不同質量濃度樣品所對應的曲線有重疊現象，難以區分，沒有明顯的質量濃度梯度依賴性，無法為后期實驗做準備。

　　H9C2 細胞對不同質量濃度的樣品反應也較靈敏。給藥后 CI 值均出現明顯波動。給藥初期，低質量濃度樣品組及對照組對 CI 值起促進作用，質量濃度越低，促進作用越強，在一段時間后趨向平穩。高質量濃度樣品組對 CI 值起抑制作用，且質量濃度越高，其抑制作用越強。整體來看，不同質量濃度所對應的曲線呈現較好的分離，H9C2 對樣品也有明顯的質量濃度梯度依賴性，可以作為后期實驗的細胞。從 CI 值變化來看，有效的質量濃度范圍應是 0.3～1.8 mg/mL。

　　圖 4 可見，給藥初期，低質量濃度樣品組及對照組對 RA-VSMC 細胞 CI 值起促進作用，但幅度較小。高質量濃度樣品組對細胞的作用過于強烈，導致 CI 值快速趨于 0，細胞接近凋亡。并且， RA-VSMC 細胞沒有明顯的質量濃度梯度依賴性。

　　綜上，選擇 H9C2 細胞作為復方丹參片溶出度評價的細胞。

　　2.3 基于 RTCA 的復方丹參片溶出度的測定及動力學模型的建立

　　2.3.1 溶液的配制 (1)空白人工胃液的配制：按照《中國藥典》2015 年版四部，取稀鹽酸 16.4 mL，加水約 800 mL 與胃蛋白酶 10 g，搖勻使其充分溶解后，加水稀釋定容至 1 000 mL，即為人工胃液�？瞻兹斯の敢旱呐渲疲撼�不含胃蛋白酶外，其余與人工胃液配制相同[15]。(2)空白人工腸液的配制：按照《中國藥典》2015 年版四部，取磷酸二氫鉀 6.8 g，加水 500 mL 使其溶解，用 0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液調節 pH 值至 6.8;另外稱取 10 g 胰蛋白酶加適量水溶解，將 2 液混合后，加水定容至 1 000 mL，即為人工腸液。空白人工腸液的配制：除不含胰蛋白酶外，其余與人工腸液配制相同[15]。(3)磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)的配制：按照《中國藥典》2015 年版四部，取磷酸二氫鉀 1.36 g，加 0.l mol/L 氫氧化鈉溶液 79 mL，用水稀釋至 200 mL，即得。

　　2.3.2 復方丹參片溶出度供試樣品的制備 (1)不同溶出時間樣品：

　　取空白人工胃液 1 000 mL 置溶出杯中，加熱至 37 ℃，調節轉籃轉速為 100 r/min，將精密稱定質量的復方丹參片分別放入轉籃內，以空白人工胃液接觸藥片時為零時刻開始計時，然后按 10、20、30、40、50、60、70 min 定時取樣，每次取樣 10 mL(立即補充同溫同體積的空白人工胃液)，用 pH 7.4 磷酸鹽緩沖液調節至 pH 6.8(模擬腸液環境)，取 10 mL 于蒸發皿水浴蒸干，用 3 mL 細胞培養液溶解，微孔濾膜濾過，取續濾液即得。(2)完全溶出樣品：另取復方丹參片 10 片，精密稱定，計算出平均片質量(W)，將稱定的片劑研細，再精密稱取相當于 W 的量，置 1 000 mL 量瓶中，加入空白人工胃液至刻度，混勻，置于(37.0±0.5)℃ 水浴中 2 h 以上，每隔 15 min 振搖 1 次。冷至室溫，取 10 mL，用 pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液調節至 pH 6.8，精確測量體積，于蒸發皿水浴蒸干，用 3 mL 細胞培養液溶解，微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

　　2.3.3 CI 測定 將 H9C2 細胞置于含 10% FBS 的 DMEM 培養基中、在 37 ℃下、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養。取對數生長期的細胞，800 r/min 離心 5 min，計數板下計數，調整細胞濃度至 2×104 個/mL，RTCA 板每孔中加入 100 μL 細胞懸液，貼壁培養過夜，24 h 后，換液，按照要求加入“2.3.2” 項下的復方丹參片溶出度供試樣品溶液 200 μL，繼續檢測 72 h，得到樣品溶液作用于 H9C2 細胞后所產生的 TCRPs 曲線，結果見圖 5。

　　由圖 5 可知，溶出時間短的樣品對 CI 呈促進趨勢，溶出時間長的樣品對 CI 呈抑制趨勢。加藥前 CI 上升，加藥后 1～2 h 內 CI 下降較快，2 h 后溶出時間短的樣品組 CI 呈穩定上升趨勢，溶出時間長的樣品 CI 持續下降，說明細胞在給藥 1～2 h 內受藥物影響最大，且呈現一定的質量濃度梯度依賴性，故選擇圖 5 所示 24.10～25.85 h 的數據(表 1)進行累積溶出率(Q)計算，并繪制溶出曲線(圖 6)。 Q=(CIi-CIck)/(CI0-CIck) CIi 指各時間點溶出樣品的 CI 值，CIck 指不加藥物時的 CI 值，CI0指藥物完全溶出時的 CI 值

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　　2.3.4 復方丹參片的 CI 溶出動力學模型擬合 為更好地考察復方丹參片的溶出情況，將利用一定的已知數學模型對該溶出過程進行擬合，這也是釋藥機制研究的常用方法。目前的模型主要有零級模型、一級模型、Weibull 模型、Higuchi 模型、Ritger-Peppas 模型等。其中零級模型考察是否恒速釋藥，一級模型考察是否非恒速釋藥。Weibull 模型應用廣泛，幾乎適用于所有溶出曲線。Higuchi 模型主要用于研究緩釋制劑等，Ritger-Peppas 模型主要用于研究圓球型制劑的釋放機制�？紤]到本實驗中復方丹參片的制劑特點，選用零級模型、一級模型及 Weibull 模型進行擬合。結果見表 2�？芍�，復方丹參片的累積溶出率與時間有很好的相關性，且與上述模型具有較好的擬合度，其中最佳擬合模型為 Weibull 模型。

　　2.4 紫外分光光度法測定復方丹參片的溶出度及擬合模型的建立

　　2.4.1 線性關系考察 量取“2.3.2”項下復方丹參片完全溶出溶液適量，用 pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液調節至 pH 6.8，濾過，將此時的濾液作為 100%溶出量，并用 pH 6.8 的空白人工腸液稀釋成相對溶出量為 90%、70%、50%、30%、20%、10%的濃度系列，以 pH 6.8 的人工腸液為空白，測定在 283 nm 條件下的 A 值。以相對溶出量為橫坐標(X)，A 值為縱坐標(Y)，計算回歸方程[16]，回歸方程為 Y=0.021 8 X-0.002 7，r=0.999 4。

　　2.4.2 穩定性試驗 吸取適量相對溶出量為50%的溶液，分別在 0、1、2、4、6、12 h 測定 A 值，結果分別為 0.064、0.065、0.065、0.066、0.064、0.065， RSD 為 1.16%，RSD<3.0%，表明藥液穩定性較好。

　　2.4.3 精密度試驗 吸取適量復方丹參片完全溶出的藥液，重復 6 次測定 A 值，測得 A 值分別為 0.127、 0.128、0.128、0.127、0.128、0.128，RSD 為 0.4%， RSD<3.0%，表明該儀器精密度良好。

　　2.4.4 樣品溶出度測定 取復方丹參片 10 片，精密稱定，計算出平均片質量(W)，將稱定的片劑研細，再精密稱取相當于 W 的量，置 1 000 mL 量瓶中，加入空白人工胃液至刻度，混勻，置于(37.0±0.5)℃ 水浴中 2 h 以上，每隔 15 min 振搖 1 次。冷至室溫，取 10 mL，用 pH 7.4 磷酸鹽緩沖液調節至 pH 6.8，取樣，微孔濾膜濾過，取續濾液用紫外可見分光光度計于 283 nm 處測定 A 值(A 總)。取空白人工胃液 1 000 mL 置溶出杯中，加熱至 37 ℃，調節轉籃轉速為 100 r/min，將精密稱定質量的復方丹參片 1 片(W1)放入轉籃內，以空白人工胃液接觸藥片時為零時刻開始計時，然后按 10、 20、30、40、50、60、70、80 min 定時取樣 10 mL (立即補充同溫同體積的空白人工胃液)，用 pH 7.4 磷酸鹽緩沖液調節至 pH 6.8，取樣，微孔濾膜濾過，取續濾液用紫外可見分光光度計于 283 nm 處測定 A 值(Ai)。按公式計算 Q。繪制溶出度曲線(圖 7)。 Q=WAi/W1A 總

　　2.4.5 復方丹參片的紫外分光光度法溶出動力學模型擬合 以零級模型、一級模型、Weibull 模型對溶出過程進行擬合，結果見表 3。復方丹參片的累積溶出率與時間有較好的相關性，與 3 種模型有較好的擬合度，其中與 Weibull 模型的擬合度最佳。——論文作者：馬曉斐 1 ，王建春 2 ，潘金火 1, 2，謝 輝 1 ，陳 軍 1 ，張 倩 1 ，韓星星 1 ，嚴國俊 1*