微流控技術在輔助生殖領域應用的研究進展

發布時間：2021-10-16所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次

摘 要： [摘要]輔助生殖技術(ART)領域進展迅速，由于臨床實踐中操作步驟繁瑣，如分選精子，卵母細胞的選擇，體外受精，胚胎培養，胚胎的監測等，所以在效率和臨床決策方面仍有進一步改進的需求。微流控技術既是技術手段也是一門科學，它是在亞微升水平研究流體的行為

　　[摘要]輔助生殖技術(ART)領域進展迅速，由于臨床實踐中操作步驟繁瑣，如分選精子，卵母細胞的選擇，體外受精，胚胎培養，胚胎的監測等，所以在效率和臨床決策方面仍有進一步改進的需求。微流控技術既是技術手段也是一門科學，它是在亞微升水平研究流體的行為特征。其檢測系統管道及檢測終端具有極大靈活性，可適用于不同的檢測目的，其檢測精度高的同時節省樣本量，具有高度集成性特征，與輔助生殖實踐中的檢測需求相匹配。應用微流控技術可以評估精子，卵母細胞和植入前胚胎結構功能和環境等基本生物學信息，并據此給予準確有效的應對方案和臨床決策�；�于上述內容，本文中我們就微流控技術在輔助生殖上的應用作一綜述，以期推進微流控技術在生殖領域的應用和完善。

　　[關鍵詞]輔助生殖技術;卵母細胞;胚胎;分選;微流控

　　微流控(microfluidics)是指通過數十到數百微米微管道精確操控微尺度流體的一門科學和技術，是一門涉及物理、化學、微電子、材料和生物醫學等眾多領域的交叉新興學科[1]。微流控將常規生物化學實驗的基本功能縮小到幾平方厘米芯片之上，具有微型化、集成化特征。其最大優勢是多種單元技術在整體可控的微小平臺上靈活組合、規模集成，使用非常少的樣本和試劑做出高精度和高敏感度的分離和檢測，費用低，分析用時短[2]，見圖1。微流控技術廣泛應用于細胞生物學、化學、遺傳學及分子生物學等領域，并開始在實驗室檢測和臨床治療等醫學領域中嶄露頭角。人類輔助生殖技術(assistedreproductivetechnology，ART)雖然取得了長足的發展，但是其效率仍然較低，因此，人們在不斷尋求新的技術手段以改善結果和提高效率。此外，輔助生殖技術由于脫離了自然選擇和體內生殖道環境，影響植入前胚胎的質量和懷孕率，可能通過表觀遺傳機制影響下一代的健康。因此，尋求新技術對輔助生殖流程進行優化更加迫切[3]�；�于微流控技術自身優勢將其應用于輔助生殖領域，將對推動輔助生殖技術發展起到重大的作用，并有可能徹底改變輔助生殖過程[4]。目前，微流控技術在ART中的應用和研究主要集中在胚胎培養上，隨著微流控技術自身的發展和完善，也逐步應用于輔助生殖實驗室配子和胚胎操作的各個環節。在本綜述中，我們將總結近年來微流控技術在配子篩選，卵母細胞成熟和胚胎培養等生殖領域中的應用，并對其發展趨勢進行展望。

　　1.微流控技術與雄性生殖細胞

　　1.1微流控精液分析:目前，男科臨床上通過1個或多個參數來評估精子質量，這些參數包括精液的液化時間，pH值、精子濃度、活力、形態和DNA完整性，以及精漿果糖等[5]。這些分析技術難度大，勞動強度高，主觀影響大，人員需要專門培訓。此外，即使是先進的計算機輔助系統(例如ComputeraidedSemenAnalysisSystem，CASA)也需要手動稀釋和混勻。操作簡便，檢測迅速，分析準確的精液分析技術的開發具有重大的現實意義。這些改變發生在2010年，Segerink等[6]研發出了一種芯片，它可以計算男性精子濃度，并衡量其流動性，該技術采用電極片進行電流的感應，在精子細胞通過時，電阻發生短暫變動可以測出精子濃度，同時，基于電阻抗的差異可以將精子、白細胞和其他細胞區分開。2017年Schaff等[7]基于微流控平臺開發出一種小型的離心裝置，這種便攜式的男性生育能力檢測儀可以讓男性在家自行進行精液質量定期監測。隨后Kanakasabapathy等[8]將智能手機與微流控檢測平臺相結合最終直接將檢測結果發送到智能手機，通過與實驗室的精液分析儀進行比較，其準確性為98%，從而成為家庭的即時診斷工具。最近，Zhou等[9]總結了近些年微流控技術在精液檢測方面的相關研究進展。

　　1.2微流控精子分選:在體外受精(invitrofertilization，IVF)中，通常要根據精液特征(如精液量、精子濃度及精子活力等)采用適當的方式將精子分離，從而進行體外受精或者卵胞質內單精子注射(intracytoplasmicsperminjection，ICSI)和供精者精液授精(artificialinseminationwithdonor’ssemen，AID)。傳統的處理方法一般是將精液簡單地培養洗滌，分離出精子進行后續操作。這種方法耗時、耗力，并且會帶來精子損傷，例如，離心過程中精子DNA的斷裂。實際上，微流控芯片在生殖醫學領域最初也是用于精液檢測。Kricka等[10]在20世紀90年代用鈉鈣玻璃和硅做材料制造的微管道設備，通過計算精子游動10mm所用的時間來測算精子數量和活力。在2003年Cho[11]和Schuster[12]等通過基于微流體和含有黏彈性介質的微通道對精子進行分離，這是因為活力較好的精子具有較高的擴散率，跨越層流線從而實現無離心的精子分離。這種方法不僅有效地減少了離心過程中損傷精子DNA產生的負面影響，同時大大提高了分離效率�；�本實現了簡單、快速、低損傷的精子處理原則，但是該方法由于制作工藝和微流體流速的限制還不能大量應用于臨床。在2014年Nosrati等[13]提出了一種臨床上可應用的微流體裝置，該裝置基于500個平行微通道中的進行性運動來選擇精子。20min內可以從1ml精液中純化出精子活力良好且DNA完整的精子。公牛精子的實驗表明，所選精子活力提高了89%以上，人類精子臨床測試顯示，人類DNA完整性提高了80%以上。Knowlton等[14]通過綜述總結了近幾十年微流控技術在精子的形態、活力、DNA完整性等方面對精子進行篩選檢測，以及其在人類和動物研究上的進展。微流控技術自身的完善以及聯合其他分析技術將會在精子分選的檢測中發揮更高的效能。

　　2.微流控技術與雌性生殖細胞

　　2.1微流控卵母細胞分選:正常成年男性每天都可以產生大量的精子，然而卵子的數量從一出生就已經決定。臨床上，通過激素促排卵，在較好的情況下每次可以獲取10枚左右的卵子，加之每個周期都很長，患者壓力也很大，因此，選擇好的卵子和選擇好的精子對于ART的成功同等重要。臨床上對于卵子的選擇通常是由專業胚胎操作師根據卵子成熟后的形態進行主觀判斷，既高度依賴人工，又忽略了卵子的發育過程，因此，很難對卵子質量進行全面評估。而現有的實時成像監測裝置造價昂貴，基于微流控平臺可以對卵子篩選實現定量分析。Angione等[15]設計了一種微流控平臺，可以及時觀察和有效記錄單個卵母細胞的發育情況和形態，這種微流控裝置通過記錄卵子的發育情況，即應用卵細胞膜的特性可對每個卵子進行仔細分析，精確地判斷。Hwang等[16]開發了一種在電場條件下質量不同卵子移動速度不同的自動化分析平臺，客觀高效地對卵子的質量進行了分選和評估。Murayama等[17]設計了一種微機械感應器，通過感應卵子表面彈性用于卵子質量評估。此外，可以通過基因組學、分子生物等方法檢測卵丘細胞中基因和蛋白的表達對卵子的狀態進行評估和分析[18，19]。

　　2.2卵母細胞體外成熟:卵母細胞體外成熟是輔助生殖的基本技術之一，通常針對一些卵子成熟障礙的不孕患者，例如，多囊卵巢綜合征、卵泡發育遲緩的患者[20]。與傳統的靜態培養方法相比較，增加微流體更利于卵母細胞的成熟。此外，通過輔助未成熟卵母細胞體外成熟培養技術可以避免卵巢過度刺激綜合征的發生。但是，由于未成熟卵母細胞體外成熟培養技術的有限性，體外成熟的卵子質量相對體內較低，所幸的是微流控技術能夠提高體外成熟卵子的質量。2001年Walters等[21]首先通過微流控裝置實現了對豬卵母細胞的體外成熟培養，與傳統的微滴法培養相比，微流控裝置顯著提高了豬卵母細胞的MII期卵子的成熟率。更具意義的是，微流控通道中卵母細胞卵丘細胞擴散減少了，即微流控通道能夠改善豬卵母細胞的核成熟，但可能限制胞質成熟，這可能是因為微流體通道的物理空間大小限制了卵丘細胞的擴散。隨后，Hester等[22]證實微流控培養的成熟卵子其受精能力也顯著高于傳統的微滴法。傳統的卵母細胞成熟技術在卵子成熟以后需要通過機械法或者酶消化法去除卵丘細胞，操作過程比較繁瑣，耗費時間，同時，這種操作可能會對胚胎的后續發育造成影響。目前，由微流控裝置已經可以通過機械法和酶消化法實現對卵丘卵母細胞復合體的卵子的剝離。此外，微流控芯片可以連續實現對小鼠成熟卵子的卵丘細胞的自動化剝離，這種芯片大大簡化了卵母細胞體外成熟的操作流程[23]。

　　3.微流控技術與體外授精

　　體外授精是ART中很重要的技術，將微流控平臺用于體外受精最大的優勢是可以實時觀察，并且控制體外受精精子量。因為常規條件下過多的精子受精會導致多核胚胎的發生，導致胚胎染色體混亂，而精子數量過少則可能降低受精率。精子的活力，卵母細胞的質量以及流體運動都會影響微流控平臺的受精結果。在體外受精中，如果精子濃度低，則將決定由ICSI進行授精，從而克服了精子濃度低導致受精率下降的問題。然而，由于使用ICSI技術具有機械侵入性，存在潛在的安全性問題，且該技術需要經驗豐富的ICSI技術人員操作[24]。而微流控平臺可以解決這一問題，是臨床ICSI的潛在替代方法。例如，Suh等[25]發現，當精子濃度低至2×107/L，與標準孔培養皿相比，在微流體平臺上的受精率明顯更高，而傳統的體外受精方式精液的濃度需要達到(0.5～1.0)×109/L。此外，將微流體IVF平臺和卵母細胞分選平臺相結合選擇高質量精子和健康的卵母細胞進行受精，則可大大提高IVF受精質量。國內的Han等[26]報告了一種新型微孔結構的微流控裝置，該裝置集合單個卵母細胞的分選，受精和胚胎培養，實現了在微流體裝置與傳統方式一樣的受精率，優勢是此微流體裝置可通過簡化卵母細胞的處理和操作流程，實現了快速方便地更換培養基以及對單個卵子持續監測和分選。這些研究都顯示了微流控芯片在體外受精研究中的優越性和潛在的應用前景。

　　4.微流控技術與胚胎

　　4.1胚胎分選:選擇好的胚胎進行移植對于臨床上能否正常妊娠顯得極為重要，甄別胚胎好壞最常用的方法是通過顯微鏡進行形態學評分。臨床上一般通過顯微鏡觀察卵裂率，胚胎細胞數量，細胞破碎程度，囊胚形態等。然而，顯微鏡觀察可能是主觀的，缺乏預測價值，實驗室內部和各個實驗室之間都有差異，且無法對胚胎的整個培養過程進行持續監測。此外，反復的胚胎觀察會影響后續胚胎發育。微流控裝置為能夠進行生化非侵入性分析和選擇胚胎提供了一條新的途徑。目前已經積累了大量用于胚胎生物標志物測量的數據，例如，氧代謝，氨基酸代謝和能量代謝等。O’Donovan等[27]開發并測試了一種呼吸微流控裝置，可以監測2細胞小鼠胚胎的耗氧量，通過在1h時間內監視多達10個植入前胚胎，該生物芯片監測2細胞胚胎和植入前胚胎細胞的耗氧量，為胚胎的篩選和評估提供了一種非侵入性、簡單且方便的方法。Urbanski等[28]通過設計微流控芯片，巧妙地通過微熒光酶分析法評估與胚胎發育相關的葡萄糖、丙酮酸和乳酸的消耗和產生情況，通過標準化自動化程序，檢測了整個培養期間單個胚胎和單個細胞進行代謝的情況。Heo等[29]在單個集成設備上，設計了能夠胚胎培養和對代謝產物進行自動分析的微流控芯片。盡管這些微流體胚胎測定法目前已用于小鼠胚胎，但尚未應用于人類胚胎，且微流控的設計和測定仍需要進一步完善。但是可以想象，基于微流控將胚胎培養和非侵入性的生物標志相結合用于胚胎篩選，將極大地提高移植胚胎質量和分選效率。

　　4.2胚胎培養:胚胎體外發育率很低的原因之一就是胚胎培養程序太多太復雜，期間各種胚胎操作的變化都會影響胚胎發育。近些年已經在精簡胚胎操作程序以提高胚胎發育質量，但是由于體外培養環境與體內差異很大，胚胎發育質量仍然較差。微流控芯片微尺度的環境能夠模擬正常生理狀況的特點，決定了它用于胚胎培養的優勢。Glasgow等[30]將小鼠受精卵在微管道中成功培養到2-細胞期。Wheeler等[31]通過微流控芯片對豬的4-細胞期胚胎進行體外培養得到囊胚，隨后進行體外移植得到5只仔豬。Raty等[32]的研究指出，小鼠早期胚胎在微流控裝置中培養后囊胚率顯著高于微滴組。國內的王維等[33]模擬人體環境構建微流控芯片，通過對小鼠受精卵持續的灌注培養，結果證實，微流控動態法對4-細胞胚胎、桑椹胚和囊胚形成率均有顯著提高。目前，通過微流控裝置對胚胎培養的研究主要集中在動物上，但最近有報道，通過微流控裝置對人類的冷凍胚胎進行了體外培養，但是結果并沒有證實微流控能夠提高后續胚胎發育質量[34]。由此看來，微流控平臺能否提高人類胚胎發育質量需要更多地研究和實驗證實。

　　4.3胚胎冷凍保存:哺乳動物卵母細胞和胚胎冷凍技術在過去幾十年間取得了巨大的進步，然而，相比新鮮卵母細胞和胚胎，冷凍保存胚胎的發育成功率依舊很低[35]。目前胚胎冷凍保存技術廣泛應用于慢性疾病，癌癥治療或者由于其他疾病將喪失生育能力的婦女[36，37]。胚胎冷凍保存分為兩種，慢速冷凍和玻璃化冷凍，目前，玻璃化冷凍技術以其高達90%的成功率應用最為廣泛，玻璃化冷凍面臨的挑戰主要來源于冷凍保護劑的滲透損傷、毒性損傷和冷凍過程中冰晶的形成。2011年Heo等[38]首先將微流控裝置用于胚胎的冷凍保存。2015年Lai等[39]建立了一種自動化的微流控冷凍平臺對大鼠的卵子和受精卵進行冷凍，結果顯示，自動化的微流控冷凍平臺顯著改善了冷凍后卵子和胚胎的形態，有效提高了胚胎發育質量。Roy等[40]開發了一種微流控裝置，這種微流控裝置能夠及時檢測在加載不同的冷凍保護劑過程中單個小鼠卵母細胞的體積變化，這種微流控裝置將對未來新的冷凍保護劑開發和改進原有的冷凍保存配方和程序起到極大的促進作用，并有望應用于人類輔助生殖中。國內的楊云等[41]制作了用于豬卵母細胞冷凍的微流控裝置，提高了卵母細胞存活率及卵裂率。周新麗等[42]設計了用于添加-去除保護劑的微流控芯片，并首次與冷凍載體相結合，對豬卵母細胞進行冷凍保存研究，也取得了不錯的效果。

　　5.微流控技術在生殖領域應用的未來

　　在過去的20年中，經過各行業人共同努力，使得微流控這一跨學科的技術在哺乳動物配子和胚胎的分離、分析和冷凍保存中取得了重大進展。但微流控技術的應用還局限在動物實驗水平上，距離人類胚胎的廣泛應用還有一段很長的路要走。同時，微流控芯片在輔助生殖上的應用還需要改進和優化。因為目前微流控技術在生殖領域的應用主要考慮的是其功能的完善和自動化操作上，其過程還相對復雜，且尚未考慮到臨床應用的便捷性和使用成本。此外，微流控技術在人類胚胎上的實驗計劃空白，微流控技術到底能否改善ART結果還需要更多的動物實驗和臨床實驗得以證實和填補。不過隨著微流控芯片的進一步研究和優化，相信可以開發出更符合臨床應用的微流控芯片。——論文作者：王中立1，2王琪3鄧娟4雷蘭杰4，5楊磊2，5*

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