發布時間：2021-10-11所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：常用光敏劑疏水性強、缺乏靶向性等問題嚴重限制了光動力療法的治療效果。雖然納米藥物載體可將光敏劑靶向遞送到腫瘤部位，但腫瘤部位的缺氧微環境嚴重削弱了光動力療法的療效。此外，光動力療法可通過誘導腫瘤細胞免疫原性死亡激活宿主免疫應答，
摘要背景：常用光敏劑疏水性強、缺乏靶向性等問題嚴重限制了光動力療法的治療效果。雖然納米藥物載體可將光敏劑靶向遞送到腫瘤部位，但腫瘤部位的缺氧微環境嚴重削弱了光動力療法的療效。此外，光動力療法可通過誘導腫瘤細胞免疫原性死亡激活宿主免疫應答，但這也受到免疫抑制微環境的限制。目的：合成目標材料并評估其組裝成復合納米粒子后的各項性能、增強光動力療法效果及聯合免疫治療的可行性。方法：通過氨基酸閉環反應、開環聚合、縮合反應等合成兩親性功能化聚賴氨酸和吲哚胺-2，3-雙加氧酶小分子抑制劑NLG8189二聚體，通過透析法將其制備為納米粒子的內核;加載全氟己烷并包裹透明質酸后得到HPe6DF納米粒子，測試該復合納米粒子的粒徑、電位、表面形貌、酶響應性、氧氣負載量、活性氧產生等能力。體外將HPe6DF納米粒子與鼠源乳腺癌細胞4T1共培養，評估納米粒子的細胞攝取、活性氧的產生、細胞毒性、細胞凋亡、免疫原性細胞死亡以及對吲哚胺-2，3-雙加氧酶的抑制等能力。結果與結論：①實驗成功制備了大小均一的球形HPe6DF納米粒子，其粒徑約150nm，電位約-20mV，該復合納米粒子具有一定的透明質酸酶響應性、優異的氧氣負載能力及活性氧產生能力;②與細胞復合培養實驗結果顯示，HPe6DF納米粒子以時間依賴的方式在胞內累積，并且在其余條件相同時，透明質酸預孵育組的熒光強度明顯弱于無透明質酸預孵育組，證明HPe6DF納米粒子可通過跨膜糖蛋白CD44介導的方式加速入胞;在光照條件下，HPe6DF納米粒子可有效提高胞內活性氧水平，從而促進細胞凋亡，進而誘導腫瘤細胞免疫原性死亡，并且可以有效抑制腫瘤細胞內吲哚胺-2，3-雙加氧酶的活性;③結果表明，HPe6DF納米粒子既可提高光動力效率、增強腫瘤細胞的免疫原性，還可以緩解腫瘤部位免疫抑制微環境。
關鍵詞：納米粒子;光動力療法;緩解缺氧;免疫療法;吲哚胺-2，3-雙加氧酶;二氫卟吩e6;活性氧;細胞凋亡;免疫原性死亡
0引言Introduction
光動力治療因其非侵入性、局部靶向、與其他治療方法兼容性強等優點成為了目前腫瘤治療研究的熱點[1-3]。通常在特定的激光照射下，光動力療法中的光敏劑可以吸收激光的能量，發生一系列化學反應后產生細胞毒性活性氧，導致腫瘤細胞凋亡和壞死，進而抑制腫瘤的生長[4-5]。然而，由于光動力療法對氧氣的依賴性，腫瘤缺氧的微環境使得光動力療效嚴重受限，在實體瘤中這一現象更為明顯[6-8]。同時，光動力療法也通過產生活性氧消耗氧氣，從而加劇腫瘤缺氧，導致光動力療法無法充分發揮治療效果。
迄今為止，研究人員已經開發出了多種緩解腫瘤缺氧的策略，例如在臨床試驗中已使用高壓氧吸入來改善氧氣水平，然而氣壓傷和高氧損傷等不良反應妨礙了其在臨床上進一步的應用。此外，也有研究者利用過氧化氫酶和二氧化錳等催化腫瘤內過氧化氫分解原位產生氧氣，但這種方法受到腫瘤細胞內過氧化氫濃度的限制[9-10]。全氟化碳因其化學和生物惰性、可靠的生物安全性及對氧氣的高溶解度被選為運輸氧氣的載體，為改善腫瘤缺氧微環境提供了一種新策略[11-13]。
光動力療法除了可以通過誘導凋亡或壞死殺死腫瘤細胞外，還會引起急性炎癥激活抗腫瘤免疫反應[14-15]。已有研究證實，光動力療法在治療中會引起腫瘤免疫原性細胞死亡，并釋放出相關抗原，促進樹突狀細胞成熟與抗原遞呈，進而導致效應T細胞的增殖和激活。然而，在腫瘤微環境中的免疫逃避機制會通過調節相關因子的表達，如上調吲哚胺-2，3-雙加氧酶的表達，進而嚴重損害光動力誘導的免疫反應[16-18]。目前，已有多種免疫檢查點抑制劑，如程序性死亡受體1抑制劑等已被用于增強光動力療法介導的免疫反應，以實現高效的聯合抗腫瘤效果[19-21]。
此外，吲哚胺-2，3-雙加氧酶作為一種免疫檢查點在多種類型的實體瘤中高表達，且它可被一些小分子藥物針對性抑制。吲哚胺-2，3-雙加氧酶可催化色氨酸代謝為犬尿氨酸，從而抑制效應T細胞的分化和增殖功能，幫助形成免疫抑制微環境[22-24]。抑制吲哚胺-2，3-雙加氧酶的活性有利于緩解腫瘤部位免疫抑制微環境。
綜上，緩解腫瘤細胞內缺氧可提高光動力療效，同時結合吲哚胺-2，3-雙加氧酶抑制劑抑制腫瘤免疫抑制微環境，可增強光動力誘發的免疫應答能力，從而進一步增強腫瘤治療效果�；诖耍瑢嶒炘O計了以光敏劑二氫卟吩e6修飾的兩親性功能化聚賴氨酸為載體材料，負載NLG8189的二聚體藥物和全氟己烷作為內核，靜電復合透明質酸為外殼的HPe6DF納米粒子，從而增強光動力療法誘導的免疫治療療效[21，25-26]。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1設計材料制備和表征以及細胞學實驗，兩組間比較進行T-test分析，多組間比較進行單因素完全隨機方差分析。
1.2時間及地點于2019年10月至2021年4月在四川大學國家生物醫學材料工程技術研究中心實驗室完成。
1.3材料
1.3.1主要細胞與試劑鼠源乳腺癌細胞4T1購自中科院上海細胞研究所;二氫卟吩-e6、胱胺二鹽酸鹽、N-芐氧羰基-L-賴氨酸、二環己基碳二亞胺、羥基丁二酰亞胺(天津希恩斯生化科技有限公司);透明質酸(Mw=40000，華熙生物科技有限公司);小分子吲哚胺-2，3-雙加氧酶抑制劑NLG8189(美國Selleck公司);全氟己烷(九鼎化學科技有限公司);氫溴酸(Adamas-beta);3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT，上海安吉耐化學)、綠色單線態氧探針(大連美倫生物技術有限公司);活性氧檢測試劑盒、三磷酸腺苷檢測試劑盒和AnnexinV/PI細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);RMPI1640培養基、胎牛血清(美國Hyclone公司);胰蛋白消化酶(0.25%)和青霉素-鏈霉素(美國Gibco公司);γ-干擾素(近岸蛋白質科技有限公司);AlexaFluor488-鈣網蛋白、AlexaFluor488-高遷移率蛋白1抗體(北京博奧森生物技術有限公司);乙醚、二氯甲烷、四氫呋喃、正己烷、二甲亞砜等(成都科龍化工試劑)。
1.3.2主要設備與儀器1H核磁共振波譜儀(美國Bruker，AV-400);質譜儀(日本島津，LCMS-IT-TOF);動態光散射儀(英國Malvern，ZetasizerNanoZS);紫外分光光度計(美國PerkinElmer，L650);透射電子顯微鏡(日本JEOL，JEM2100);便攜式溶氧儀(上海儀電);酶標儀(美國Biorad，Model-550);高效液相色譜(HPLC，美國Aligent);激光共聚焦顯微鏡(德國Leica，TCPSP5);流式細胞儀FCM(美國BD，AccuriC6)。
1.4實驗方法
1.4.1兩親性功能化聚賴氨酸的合成首先，將N-芐氧羰基-L-賴氨酸和三光氣按摩爾比1∶1.3加入到重蒸后四氫呋喃溶劑中，50℃油浴下反應至溶液變澄清。將上述溶液旋濃后，使用大量無水正己烷反復沉淀清洗后得到賴氨酸內羧酸酐。然后，將脫鹽酸后的胱胺和賴氨酸內羧酸酐按1∶20的摩爾比投入無水二氯甲烷中，反應48h后將溶液濃縮，加入大量乙醚沉淀。將過濾后得到的沉淀溶于三氟乙酸，并加入溴化氫的醋酸溶液反應3h，用乙醚沉淀后，將沉淀溶于水中透析4d后凍干得到聚賴氨酸。接著，將二氫卟吩e6、二環己基碳二亞胺和羥基丁二酰亞胺按摩爾比1∶1.21∶10投入10mL二甲亞砜中活化2h后，按聚賴氨酸和二氫卟吩e6摩爾比為1∶1.1的比例加入聚賴氨酸，反應48h后，用二甲亞砜透析除去未反應的二氫卟吩e6，再用水透析后凍干得到兩親性功能化聚賴氨酸。
合成材料采用1H核磁共振波譜儀進行了結構表征，結果顯示：聚賴氨酸主鏈上的質子(δ=4.33ppm);胱胺上的兩種亞甲基上的質子(δ=2.78，3.87ppm);聚賴氨酸側鏈上的4個亞甲基上的質子(δ=2.78，1.60，1.36，1.25ppm)以及δ=7.4-8.5ppm處代表二氫卟吩e6的質子峰均在核磁氫譜中出現，證明成功合成了兩親性功能化聚賴氨酸。
1.4.2NLG8189小分子二聚體的合成用上述合成賴氨酸內羧酸酐的方法合成NLG8189內羧酸酐后，將胱胺和NLG8189內羧酸酐按摩爾比1∶2加入到無水二氯甲烷中反應48h，用乙醚沉淀并過濾后得到最終產物NLG8189小分子二聚體。用核磁和質譜分別進行了表征，核磁氫譜結果顯示：苯環上4個氫(δ=7.00，7.12，7.35，7.55ppm)、與氮相連的甲基(δ=3.72ppm)、NLG8189亞甲基上2個氫δ=3.05，3.60ppm)、與氨基相連的碳上的質子(δ=4.18ppm)及胱胺上兩種亞甲基質子(δ=3.65，2.67ppm)均出現在核磁氫譜中，證明成功合成了NLG8189小分子二聚體。高分辨率質譜中NLG8189小分子二聚體顯示的分子量為552.76g/mol，與理論分子量相同，表明NLG8189小分子二聚體的結構與預期相同。
1.4.3納米粒子的制備將500μL含有5mg兩親性功能化聚賴氨酸和1mg的NLG8189小分子二聚體的二甲亞砜溶液緩慢滴加到9mL水中，攪拌過夜，透析除去二甲亞砜后得到Pe6D納米粒子。在超聲下將5μL全氟己烷滴加到1mLPe6D納米粒子中，5000r/min離心后得到Pe6DF納米粒子。然后將Pe6DF納米粒子和10g/L的透明質酸按體積比5∶1混合，渦旋1min后得到HPe6DF納米粒子。將透析的Pe6D納米粒子和10g/L的透明質酸按體積比5∶1混合，渦旋1min后得到HPe6D納米粒子。
1.4.4納米粒子的理化性能表征
粒徑和電位：Pe6D、Pe6DF、HPe6DF納米粒子的粒徑和電位通過動態光散射來表征。通過檢測HPe6DF納米粒子在透明質酸酶孵育下的粒徑和電位隨時間變化，評估其酶響應特性;通過檢測HPe6DF納米粒子在體積分數10%血清溶液和5%葡萄糖溶液中的粒徑和電位隨時間變化，評估其穩定性。
載藥量：用紫外分光光度計測定二氫卟吩e6含量，配制不同濃度的二氫卟吩e6溶液做標準曲線，測量其在660nm處的吸光度值，并繪制濃度-吸光度值曲線，計算樣品中的二氫卟吩e6含量。使用高效液相色譜測定NLG8189的載藥量，配制不同濃度的NLG8189溶液做標準曲線，高效液相色譜測定，以峰面積對濃度進行線性回歸，做標準曲線并計算樣品中NLG8189含量。其中色譜柱為C18柱(EclipseXDB-C184.6mm×150mm，5μm，Aligent)，流動相為乙腈∶水=10∶90(均含0.1%三氟乙酸)，流速為0.5mL/min。載藥量=A/(A+B)×100%，其中A為納米粒子中藥物質量，B為納米粒子中載體材料質量。
形貌表征：使用透射電子顯微鏡觀察Pe6DF、HPe6DF納米顆粒的形貌。
氧氣負載能力：將2mL的HPe6D、HPe6DF納米粒子分別裝在10mL離心管中，用氧氣瓶向溶液中鼓氧，每秒一個氣泡的頻率鼓氧1min后，使用便攜式溶氧儀檢測其在15min內的溶解氧含量。
活性氧產生能力：使用激光(660nm，0.5W/cm2)照射含有50μmol/L綠色單線態氧探針的HPe6D、HPe6DF納米粒子溶液，然后測量其在504nm激發下514-580nm的發射曲線。
1.4.5細胞實驗
細胞培養：將鼠源乳腺癌細胞4T1以5×105/皿的濃度接種于直徑10cm的培養皿，并添加含有體積分數10%血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的RPMI1640培養基，在體積分數5%二氧化碳環境下于37℃細胞培養箱中進行培養，當細胞生長至70%-80%時進行傳代，每2d傳代一次。
細胞攝取：將4T1細胞以5×104/皿的密度接種在玻底皿中，待細胞貼壁后，加入含HPe6DF納米粒子(二氫卟吩e6的質量濃度為4mg/L)和透明質酸+HPe6DF納米粒子(提前加入質量濃度10g/L的透明質酸預孵育2h)的培養基分別繼續培養細胞1，2，4h。孵育結束后，用Hoechst33342(10mg/L)染色15min，通過激光共聚焦顯微鏡觀察納米粒子入胞情況。對于細胞攝取效率的定量分析，在納米粒子與細胞孵育1，2，4h后，消化并收集細胞，制成單細胞懸液后用流式細胞儀FCM定量檢測二氫卟吩e6的熒光強度。
胞內活性氧產生：將4T1細胞以5×104/皿的密度接種在玻底皿中，待細胞貼壁后，分別加入HPe6D和HPe6DF納米粒子(二氫卟吩e6的質量濃度為2mg/L)孵育4h。孵育完成后先移除培養基，再加入500μL濃度為10μmol/L的活性氧檢測探針DCFH-DA孵育30min。使用660nm的激光燈(1W/cm2)照射1min后加入Hoechst33342溶液染核，最后用激光共聚焦顯微鏡獲取熒光圖像。對于流式定量分析，在光照后直接消化收集細胞上機檢測。對照組為單純培養的4T1細胞，不進行光照處理，在與活性氧檢測探針DCFH-DA探針孵育后直接進行分析。
細胞毒性：將4T1細胞按5×103/孔的密度接種到96孔板中孵育24h，再將HPe6D、HPe6DF和HA+HPe6DF納米粒子按二氫卟吩e6濃度為0.5，1，2，4，6mg/L分別加入孔板中。孵育4h后移除上清液，并更換新鮮培養基，用660nm的激光燈(1W/cm2)照射1min，再孵育20h后，吸出培養基加入0.5g/LMTT溶液孵育4h，加入二甲亞砜震蕩3min，用酶標儀檢測490nm處吸光度值，計算細胞存活率。
細胞凋亡：將4T1細胞按1×105/孔的密度接種到6孔板中，孵育24h后，分別加入二氫卟吩e6質量濃度為4mg/L的HPe6D和HPe6DF納米粒子。孵育4h后更換新鮮培養基，再用660nm的激光燈(1W/cm2)照射1min，再孵育4h。最后消化收集細胞，經細胞凋亡檢測試劑盒染色后，用流式細胞儀檢測。
免疫原性細胞死亡相關因子檢測：將4T1細胞按5×104個/皿的密度接種到玻底皿中，孵育24h后，分別加入二氫卟吩e6質量濃度為2mg/L的HPe6D和HPe6DF納米粒子。對照組為單純培養的4T1細胞，不進行光照處理。孵育4h后，移除上清液更換新鮮培養基，用660nm的激光燈(1W/cm2)照射1min，再孵育4h后，分別加入稀釋300倍的AlexaFluor488-鈣網蛋白和AlexaFluor488-高遷移率蛋白1抗體(500μL)孵育1h，最后用激光共聚焦顯微鏡觀察。對于三磷酸腺苷的檢測，在光照完孵育4h后取上清液離心，采用三磷酸腺苷檢測試劑盒檢測上清液中三磷酸腺苷的濃度。
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胞內吲哚胺-2，3-雙加氧酶活性的抑制檢測：將4T1細胞按5×103孔的密度接種到96孔板中，并加入終質量濃度為50µg/L的γ-干擾素孵育24h，然后分別加入NLG8189和HPe6DF納米粒子孵育48h。對照組為單純培養的4T1細胞，不進行任何處理。最后每孔取150μL上清液到新的96孔板中，再分別加入75μL30%三氯乙酸沉淀蛋白質，50℃孵育30min后，5000r/min離心8min，取150μL上清液加入75μL含有2%對二甲氨基苯甲醛的冰醋酸溶液，測定其在490nm處的吸光度值。
1.5主要觀察指標HPe6DF納米粒子的理化性能及體外抗腫瘤效果。
1.6統計學分析實驗數據的統計結果均以x-±s表示，兩組之比較進行T-test分析，多組間比較進行單因素完全隨機方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有顯著性意義。
2結果Results
2.1HPe6DF納米粒子的理化性能采用透析法制備納米粒子內核Pe6D，Pe6D加載全氟化碳并包裹透明質酸后得到HPe6DF納米粒子，并使用動態光散射儀和透射電鏡等對其粒徑、電位和形貌等進行表征。
圖1A、B是不同納米粒子的粒徑、電位測試結果，Pe6DF納米粒子的粒徑約為90nm，電位約為+45mV;HPe6DF納米粒子的粒徑增大到150nm，電位降低到-20mV。圖1C、D的透射電鏡圖像展示了包裹透明質酸前后納米粒子的形貌，包裹透明質酸前的Pe6DF納米粒子呈大小均一的球形，包裹透明質酸后的HPe6DF納米粒子粒徑增大并具有核殼結構。
圖2A、B為HPe6DF納米粒子與透明質酸酶(100-250U/mL)共同孵育不同時間的粒徑和電位變化圖，從圖中可以看出，隨著時間的增加，HPe6DF納米粒子的粒徑和電位均逐漸增加，表明其具有一定的透明質酸酶響應性。圖2C是HPe6DF納米粒子孵育在體積分數10%血清和5%葡萄糖溶液中粒徑隨時間的變化曲線，從圖中可以看出，隨著培養時間的延長，HPe6DF納米粒子在體積分數10%血清和5%葡萄糖溶液中孵育時粒徑幾乎未發生變化，電位測試結果也保持正常波動。圖2D是不同樣品中的溶解氧含量隨時間變化，從圖中可以看出，在加載氧氣前各組氧氣濃度基本相同，在加載氧氣后各組氧氣濃度均明顯上升，且HPe6DF組氧氣濃度最高。由紫外和高效液相色譜分別檢測了二氫卟吩e6和NLG8189的載藥量，二者的載藥量分別為11.84%和5.41%。
圖3是HPe6D和HPe6DF納米粒子在溶液中產生活性氧能力評估實驗的結果，由圖中可以看出，在光照相同時間的條件下，與HPe6D組相比，HPe6DF組熒光強度增加更為明顯，表明其活性氧產量更高。
2.2腫瘤細胞對HPe6DF納米粒子的攝取圖4，5分別是細胞對HPe6DF納米粒子攝取的激光共聚焦圖像和流式檢測結果，可以看出隨孵育時間的增長，細胞中代表二氫卟吩e6的紅色熒光逐漸增強;并且在納米粒子濃度和孵育時間相同的條件下，透明質酸預孵育組紅色熒光較弱;流式定量結果中熒光強度變化與激光共聚焦結果一致。
2.3腫瘤細胞胞內活性氧產生圖6A、B分別為不同處理條件下細胞內的活性氧產生情況的激光共聚焦顯微鏡圖片和流式結果圖，與對照組相比，光照后的HPe6D組和HPe6DF組均出現了明顯綠色熒光，且HPe6DF組熒光最強。流式定量結果與激光共聚焦顯微鏡圖像結果一致。
2.4HPe6DF納米粒子的細胞毒性和對細胞凋亡的影響圖7A、B顯示了不同納米粒子處理下在有無光照時的細胞存活率，在不光照條件下，各組均無明顯毒性;光照后，細胞毒性以劑量依賴的方式增加，其中HPe6DF處理組細胞存活率最低，表明其最低毒性最大，且透明質酸預孵育處理組細胞存活率明顯更高。圖7C展示了細胞經過不同處理后的凋亡情況，無光照的條件下，HPe6D組凋亡比例與生理鹽水組幾乎相同;光照后，HPe6D組和HPe6DF組的晚期凋亡比例分別達到22.2%和37.8%。——論文作者：蔡勝勝，梅衡，張學全，鄧勁，曹俊，何斌
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