發布時間：2021-10-09所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：微弧氧化技術目前已被較多用于提高鈦植入體骨整合性的研究中，在鈦表面構建出多種含不同活性元素的多孔涂層。近年來研究發現，紅景天苷具有較好的促成骨活性。聚多巴胺作為材料表面優良的黏合劑和二次吸附的載體具有較好負載活性分子的特性。目的
摘要背景：微弧氧化技術目前已被較多用于提高鈦植入體骨整合性的研究中，在鈦表面構建出多種含不同活性元素的多孔涂層。近年來研究發現，紅景天苷具有較好的促成骨活性。聚多巴胺作為材料表面優良的黏合劑和二次吸附的載體具有較好負載活性分子的特性。目的：為進一步提高鈦表面微弧氧化涂層的促成骨能力，在多孔形貌表面構建骨整合性優良的復合涂層。方法：在純鈦表面制作微弧氧化涂層，記為MAO組;進一步在微弧氧化涂層表面制作聚多巴胺涂層，記為PDA組;在聚多巴胺涂層表面加載1，2，4g/L的紅景天苷，依次記為Sal-1組、Sal-2組、Sal-4組，利用掃描電鏡及X射線能譜儀分析各組涂層的微觀形貌、表面元素含量及分布;通過CCK-8及熒光染色實驗評估各組涂層表面的細胞增殖活性，通過堿性磷酸酶染色、茜素紅染色實驗觀察各組涂層的促成骨分化及礦化能力;利用計算機分子對接技術預測紅景天苷分子的潛在促成骨靶點。結果與結論：①掃描電鏡顯示，5組試件表面為多孔微米形貌結構，平均孔徑相似;X射線能譜儀分析顯示，通過聚多巴胺載體可將紅景天苷加載到微弧氧化涂層表面;②CCK-8實驗顯示，Sal-2組、Sal-4組培養第3，5天的MC3T3-E1細胞存活率高于MAO組(P<0.05);熒光染色實驗顯示，5組試件表面MC3T3-E1間形態差異較明顯，與MAO組相比，Sal-2組、Sal-4組細胞形態更好、鋪展面積大，與相鄰細胞連接較好;③Sal-2組、Sal-4組培養第4，7天的的堿性磷酸酶活性高于MAO組(P<0.05);培養21d時的茜素紅染色顯示，各組均有一定程度的鈣結節出現，其中Sal-2組、Sal-4組的鈣結節數量更加明顯;④計算機分子對接結果表明，細胞外調節蛋白激酶2、c-Jun氨基末端激酶3、雌激素受體β、孕激素受體可能是紅景天苷發揮促成骨作用時活性較強的靶點;⑤結果表明，通過聚多巴胺將紅景天苷負載到鈦微弧氧化涂層表面，適當加載量的紅景天苷較好地改善了微弧氧化涂層的促成骨活性。
關鍵詞：材料;純鈦;表面改性;微弧氧化;聚多巴胺;紅景天苷;成骨活性;分子對接
0引言Introduction
鈦是一種高光澤的過渡金屬，具有低密度、高強度、高斷裂韌性、較好的生物相容性和耐腐蝕性等特點[1]。光滑表面的鈦植入物沒有生物活性，因此它們不具備較好的骨整合性能，最近的研究集中于利用表面改性技術賦予鈦植入體較好的生物活性[2]。
表面改性技術用于改善植入體表面的生物相容性并使其具備特定的生物學功能，從而減少并發癥并延長植入體的使用壽命[3]。鈦植入體的表面改性方法主要有機械方法、物理方法與生物化學方法[4]。微弧氧化技術作為一種物理改性方法已被證明是用于增強鈦植入體骨整合性的有效表面處理方法，并且已開發出多種生物活性元素摻入的多孔涂層[5]。先前的研究發現，微弧氧化處理可以使得鈦植入體表面形成多孔微米結構，這種結構特性有助于成骨細胞的快速黏附和增殖[6-8]。WANG等[9]的研究表明，微弧氧化處理后得到的二氧化鈦/硅磷(TiO2/SiP)涂層顯著促進了MC3T3-E1細胞的早期增殖、后期分化和骨礦化能力。此次實驗旨在進一步提高TiO2/SiP涂層的促成骨能力，在多孔微米形貌表面構建復合涂層。
利用聚多巴胺進行植入物表面處理屬于生物化學改性方法，多巴胺在堿性環境下可自聚成交聯的強黏性聚多巴胺納米層，結合于材料表面的聚多巴胺具有吸附生長因子和小分子化合物的能力[10-11]。LEE等[12]將重組人骨形態發生蛋白通過聚多巴胺層固定在三維打印的聚己內酯支架上，顯著增強了小鼠胚胎成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1)的增殖和成骨活性。
紅景天苷是從紅景天根中提取的主要活性化合物，具有多種藥理作用[13]。梅國華等[14]的研究發現，紅景天苷通過調控人成骨樣細胞系(MG-63)的細胞周期分布及上調Runx2和Osterix表達促進其增殖和成骨分化。最新研究報道，紅景天苷對大鼠顱骨成骨細胞的增殖、分化及礦化有明顯的促進作用[15]。
實驗利用聚多巴胺載藥技術在多孔微米表面加載具有骨誘導作用的紅景天苷形成復合涂層，發揮協同成骨作用;從涂層表面微觀結構及元素分布、涂層對MC3T3-E1細胞的增殖、堿性磷酸酶活性及細胞礦化影響兩個方面對載紅景天苷聚多巴胺-多孔微米復合涂層的材料學特性、細胞相容性和促成骨活性進行研究，并利用分子對接技術預測紅景天苷的潛在促成骨靶點，研究結果為被紅景天苷功能化的醫用鈦植入體，作為具有較好骨整合性的植入材料提供了理論依據。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1設計材料及藥物加載工藝、細胞學基礎實驗及計算機分子對接。
1.2時間及地點實驗于2019年8月至2020年8月在上海健康醫學院附屬嘉定區中心醫院中心實驗室完成。
1.3材料醫用純鈦(TA1，寶雞市正豐有限公司);MC3T3-E1細胞(中科院上海細胞庫);alpha-MEM培養基、胎牛血清(Gibico，USA);鬼筆環肽、DAPI(Solarbio，中國);CCK-8試劑盒(東仁，日本);茜素紅、成骨誘導培養基(賽業，中國);堿性磷酸酶檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);多聚甲醛(biosharp，中國);十六烷基氯化吡啶(Sigma，USA);PBS、Tris-HCl緩沖液(碧云天，中國);紅景天苷(成都瑞芬思生物科技有限公司);鹽酸多巴胺(上海阿拉丁試劑公司);場發射掃描電鏡SU8010(日立，日本);能譜儀(X-MAX150，牛津，英國);恒溫箱(賽默飛，中國);熒光顯微鏡、倒置顯微鏡(Leica，德國)。
1.4方法
1.4.1純鈦-微弧氧化處理工藝將醫用純鈦進行切割加工處理，處理后得到長寬均為10mm、厚度為1mm的純鈦試片，再分別經240-1500目砂紙逐級打磨至表面光滑且無痕。放入無水乙醇中超聲清洗5min，蒸餾水沖洗3遍。純鈦試片浸泡在六偏磷酸鈉5g/L、硅酸鈉12g/L、氫氧化鈉3g/L、甘油2g/L組成的電解液中，進行微弧氧化處理。微弧氧化設備(中國東莞微弧環保公司)-70kW雙極性脈沖微弧氧化電源，電流3A/dm2，頻率600Hz，占空比25%，處理時間5min。
1.4.2聚多巴胺載紅景天苷涂層制備及試件分組將微弧氧化處理后的鈦片放入無水乙醇中超聲清洗10min，蒸餾水沖洗3次。自然晾干后放入3mol/L氫氧化鈉水溶液中，60℃水浴1h，進行堿活化處理，然后用蒸餾水沖洗3次。再放入含0.5g/L多巴胺的Tris-HCl(pH=8.5)緩沖液中，避光浸泡12h。取出后，用蒸餾水沖洗3次，自然晾干。將晾干后的純鈦-微弧氧化-聚多巴胺試件分別放入，1，2，4g/L的紅景天苷PBS溶液中，浸泡12h。取出后用蒸餾水沖洗3次，自然晾干，以備使用。使用前在紫外滅菌箱中，正反面各照射2h。
將純鈦-微弧氧化處理試件編號為MAO組，純鈦-微弧氧化-聚多巴胺-0g/L紅景天苷試件編號為PDA組，純鈦-微弧氧化-聚多巴胺-1g/L紅景天苷試件編號為Sal-1組，純鈦-微弧氧化-聚多巴胺-2g/L紅景天苷試件編號為Sal-2組，純鈦-微弧氧化-聚多巴胺-4g/L紅景天苷試件編號為Sal-4組。
1.4.3材料表面形貌表征及元素分布測定利用場發射掃描電鏡SU8010觀察涂層的表面形貌，并用能譜儀X-MAX150對涂層的元素組成及分布進行分析。
1.4.4MC3T3-E1細胞活力測試及細胞骨架形態學觀察選取傳代培養后處于對數生長期的MC3T3-E1細胞，經0.25%胰蛋白酶消化，將細胞濃度調整為2×107L-1。5組試件平鋪在24孔細胞培養板中，將1mL細胞液接種在含試件的孔中，每組設置3個復孔，各自恒溫箱內培養3，5d后棄去上清液，PBS沖洗3次，按比例放入CCK-8與無血清培養基的混合液。繼續培養1.5h后吸取上清液100µL，放入96孔細胞培養板中，用酶聯免疫測試儀上測定吸光度值。以上實驗重復3次。細胞存活率=(實驗孔A值-空白孔A值)/(對照孔A值-空白孔A值)×100%。其中將MAO組作為對照孔，CCK-8與無血清培養基的混合液作為空白孔。
分別將5組試件平鋪在24孔板中，將對數生長期的MC3T3-E1細胞液加入含有試件的孔中，每孔1mL，細胞濃度為2×107L-1。恒溫箱內培養24h后，吸取上清液并用PBS沖洗3次。按0.5mL/孔加入40g/L多聚甲醛，37℃恒溫下固定10min，PBS沖洗3次。分別采用鬼筆環肽和DAPI對細胞進行染色，熒光顯微鏡下觀察細胞形態。
1.4.5堿性磷酸酶細胞成骨活性檢測堿性磷酸酶是成骨細胞早起分化的關鍵酶，堿性磷酸酶的分泌量可在一定程度上反映細胞成骨分化狀態。為觀察不同涂層對成骨細胞分化的影響，采用氨基安替吡啉測酚法檢測分析不同涂層對MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶分泌的影響。將5組試件平鋪在24孔板中，取1mL對數生長期的MC3T3-E1細胞液加入含有試件的孔中，細胞濃度為2×107L-1，加入成骨誘導液(成分：基礎培養基、雙抗、谷氨酰胺、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松)誘導培養(2d更換一次培養液)，每組設置6個復孔。培養4，7d后，吸取各孔200μL上清液至1.5mL離心管中，1000r/min離心5min。使用堿性磷酸酶檢測試劑盒，取30μL上清液置于96孔板中，分別加入50μL緩沖液和基質液，待混合均勻后37℃恒溫孵育15min，加入150μL顯色劑，混勻，于520nm波長下測定吸光度值。以上實驗重復6次，求出平均值。
1.4.6茜素紅染色滅菌后的試件在細胞培養環境中的成骨誘導培養基中浸泡24h，制備提取物。根據ISO10093標準，試件表面積與介質的比例設定為1.25cm2/1mL，采集不同試件的提取物，4℃條件下保存，用于細胞礦化實驗[16]。
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將對數生長期MC3T3-E1細胞以2×104/孔接種到含有提取物的24孔板中，成骨誘導培養21d，每2d更換一次成骨培養液，每組設置3個復孔。第21天時吸除培養基，并用PBS沖洗細胞，在40g/L多聚甲醛中固定半小時后，茜素紅染色觀察成骨細胞分化情況。用PBS沖洗3次，去除非特異性染色，倒置顯微鏡拍攝結節照片后，用10%十六烷基氯化吡啶溶解結節，在562nm處測定吸光度[17]。
1.4.7紅景天苷的骨代謝靶點預測根據文獻報道的骨代謝相關的信號通路，主要有絲裂原激活蛋白激酶通路、骨形態發生蛋白通路、Wnt/β-catenin信號通路，利用PDB蛋白數據庫(http://www.rcsb.org/)，將骨代謝相關信號通路上蛋白靶點的三維結構信息及相應原配體信息，整理成骨代謝相關靶蛋白庫(表1)[18]。將上述骨代謝相關靶蛋白與其對應的原配體，進行分子對接，并將得到的對接自由能作為參考�；衔锱c蛋白的結合自由能越低，說明該對接越穩定，結合情況越好[19]。結合自由能值小于-20.9kJ/mol，說明化合物與蛋白可以自發結合[20]。將紅景天苷與每個骨代謝相關蛋白進行對接，當結合自由能值小-20.9kJ/mol時，將該蛋白視為紅景天苷的潛在靶點。實驗使用AutoDockVina軟件進行分子對接[21]，每個蛋白的活性位點信息由計算原配體所在位置獲得。
1.5主要觀察指標①不同涂層表面的微觀形貌、元素含量及分布;②不同涂層表面MC3T3-E1細胞增殖活性及形態觀察;③不同涂層對MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶分泌量的影響;④不同涂層對MC3T3-E1細胞礦化的影響;⑤計算機分子對接中，紅景天苷分子與各個蛋白的結合自由能值。
1.6統計學分析實驗中的原始數據用Graphpadprism.7軟件進行處理，利用單因素方差分析(One-WayANOVA)對所得數據進行統計學分析，統計數據均用x-±s表示，P<0.05認為兩組數據差異有顯著性意義。
2結果Results
2.1各涂層表面微觀形貌特征掃描電鏡分析表明，見圖1，經過微弧氧化處理后純鈦表面成功構建了多孔微米形貌結構。MAO組、PDA組、Sal-1組、Sal-2組、Sal-4組試件表面的平均孔徑分別為3.68，3.16，3.60，3.29，3.76µm。經過單因素方差統計分析，各組之間均孔徑比較差異無顯著性意義(P>0.05)，說明通過聚多巴胺對微弧氧化表面改性后對多孔形貌沒有影響，涂層依然具有良好的多孔微米特征。
2.2材料表面元素含量及分布能譜儀分析表明，經過微弧氧化處理后，純鈦表明成功摻入Si、P活性元素;與MAO組相比，PDA組出現了C元素的分布，提示聚多巴胺成功載入到微弧氧化表面;隨著加載的紅景天苷質量濃度的升高，涂層表面的C元素含量也隨之升高，間接提示藥物成功地加載到涂層表面，見圖2A。根據能譜儀maping結果，幾種元素在涂層表面分布較為均勻，見圖2B。
2.3各組涂層表面細胞活力及形態觀察采用細胞電化學方法檢測MC3T3-E1細胞的增殖活性。培養第3天時，和MAO組相比，PDA組對細胞增殖無明顯促進作用;和MAO組相比，Sal-2組和Sal-4組均對細胞增殖有明顯的促進作用，見圖3A。培養第5天時，和MAO組相比，Sal-2組、Sal-4組依然對細胞增殖具有明顯促進作用，見圖3B。進一步采用DAPI鬼筆環肽染色法觀察各組細胞形態，各組細胞形態差異較明顯，與MAO組相比，Sal-2組、Sal-4組細胞形態更好、細胞鋪展面積大，與相鄰細胞連接較好，見圖4。
2.4各組涂層表面細胞堿性磷酸酶活性誘導培養第4天時，和MAO組相比，PDA組、Sal-1組的堿性磷酸酶活性無明顯差異，Sal-2組、Sal-4組的堿性磷酸酶活性明顯升高，見圖5，這也進一步證明了能譜儀元素檢測的結果，可能由于Sal-1組加載的藥物量較低，使其無法達到較好的促細胞分泌堿性磷酸酶效果。誘導培養第7天時，和MAO組相比，Sal-1組對堿性磷酸酶分泌仍然無顯著作用，Sal-2組、Sal-4組依然顯著的促進了堿性磷酸酶分泌，見圖5。這進一步提示了，紅景天苷可能需要一個較高的加載濃度才能發揮較好的促成骨分化作用。
2.5各組涂層表面細胞礦化能力茜素紅染色顯示，誘導培養21d的各組成骨細胞均有一定程度的鈣結節出現，其中Sal-2組、Sal-4組的鈣結節數量更加明顯，見圖6A，提示可能具有更好的促成骨分化作用。將各組鈣結節溶解下來后在562nm波長下測量吸光度值，發現Sal-2組、Sal-4組的促細胞礦化能力與MAO組相比顯著增加，見圖6B。這也提示，通過加載紅景天苷到TiO2/SiP涂層表面可以進一步提高涂層的促細胞礦化能力。
2.6紅景天苷的潛在促成骨靶點對紅景天苷與17個骨形成相關靶點的分子對接結果進行分析，發現紅景天苷與各個靶點的結合自由能值均小于-20.9kJ/mol，見表2。
提示其可能通過多靶點發揮較好的促進骨形成作用，比較紅景天苷與各靶點的原配體的結合自由能值，將二者差值視為相對得分(原配體結合自由能值-紅景天結合自由能值)，相對得分越高，說明紅景天苷越接近該蛋白與其原配體的結合穩定性。紅景天苷相對得分較高的靶點有，細胞外調節蛋白激酶2、c-Jun氨基末端激酶3、雌激素受體β、孕激素受體，因此推測這4個靶點可能是紅景天苷發揮促成骨作用時，活性較強的靶點。部分分子對接作用力情況，如圖7所示。
2.7涂層生物相容性由涂層表面細胞活力及形態觀察實驗可知，載紅景天苷-聚多巴胺-多孔微米復合涂層具有良好的細胞相容性。——論文作者：梁鵬晨1，2，3，史俊峰2，4，孫苗苗1，2，梁冬雨2，3，沙爽2，5，易清清2，3，常慶1，2
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