發布時間：2022-06-01所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要：應用研制的輝光放電低溫等離子體殺菌設備，以大腸桿菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、黃曲霉菌、白色念珠菌6 種微生物為實驗菌株，探討輝光放電低溫等離子體殺菌技術對不同微生物的殺菌動力學;應用掃描電鏡、透射電鏡、DNA電泳、光譜分析
摘 要：應用研制的輝光放電低溫等離子體殺菌設備，以大腸桿菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、黃曲霉菌、白色念珠菌6 種微生物為實驗菌株，探討輝光放電低溫等離子體殺菌技術對不同微生物的殺菌動力學;應用掃描電鏡、透射電鏡、DNA電泳、光譜分析等技術，探討輝光放電低溫等離子體的殺菌機制。結果表明：輝光放電低溫等離子體殺菌技術對大腸桿菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、黃曲霉菌、白色念珠菌6 種微生物的有效殺滅時間分別為2、1.5、3、4、10、10 min。依據殺菌動力學曲線，可以將 6 種微生物準確分為革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌和真菌3 類，這可能與微生物的細胞壁結構有關;輝光放電低溫等離子體可能是通過帶電的高能粒子對細菌的細胞壁造成破壞，進而殺死細菌。該研究為輝光放電低溫等離子體技術廣泛用于微生物殺菌提供了重要的方法依據。
關鍵詞：低溫等離子體;輝光放電;殺菌;動力學;機制
致病菌是引起人類疾病的重要因素之一，對人類健康造成極大的危害，也是食品安全的重大隱患。鑒于致病菌對食品安全及人類健康的巨大威脅，對它們的有效殺滅非常重要。目前常用的食品滅菌技術主要有加熱滅菌、輻照滅菌和化學殺菌等。加熱滅菌所需的高溫通常會破壞食品原有的色、香、味、形，對食品品質和營養的影響很大，而且加熱滅菌能耗也較高，限制了其應用范圍。輻照滅菌是一種新型有效的殺菌方法，其應用越來越廣泛，但輻照食品是否對人類健康有危害的困惑目前仍未明晰，像歐盟等一些國家對輻照食品仍持相當嚴格和謹慎的態度，另外像日本核泄漏、河南杞縣“鈷 60事件”等放射物質泄漏事件也引起了人們對輻照技術使用的戒備心理�；瘜W殺菌的化學消毒劑一方面會影響食品原有的色、香、味，最重要的是其化學副產物直接威脅著人類健康。鑒于上述問題，開發清潔、安全、高效、環保的殺菌新技術顯得尤為重要。
等離子體是氣體在受到外界高能量(高溫、強電磁場、輻射等)作用時電離產生的一種高度電離的氣體，其中的正負電荷總數相等，呈電中性，因而稱為等離子體。低溫等離子體是相對于其體系中的高溫電子而言，即在低溫等離子體系中，電子的溫度很高，可達上千乃至上萬攝氏度，而其中的離子及分子的溫度與常溫相當，所以整個體系在宏觀上表現為常溫[1-3]。但其體系中的高能電子及各種激發態離子都具有很高的活性，可以實現對微生物的快速殺滅[4-7]。低溫等離子體殺菌技術較傳統殺菌技術具有低溫、快速、綠色、環保等優點。特別在食品殺菌中的應用方面，更具有無殘留、營養成分無破壞等無可比擬的優點。目前，關于低溫等離子體技術研究的重點主要體現在殺菌技術的開發及應用方面。但是關于低溫等離子體殺菌技術對不同種類微生物的殺菌動力學研究鮮有報道。另外，關于低溫等離子體的殺菌機理，有研究表明溫度、紫外線、高壓電場、帶電粒子以及活性氧(reactive oxygen species，ROS)都在低溫等離子體的滅菌過程中起主要作用[8-12]。但迄今為止還沒有一個比較圓滿的答案。Montie等[9]對常壓低溫等離子體殺菌提出了3 種假設：氫氧活性基團引起脂質的過氧化而失活、氨基酸氧化導致蛋白質氧化引起的微生物失活以及氧化活性基團引起的DNA氧化失活。石興民等[13-14] 研究表明帶電粒子和ROS在低溫等離子體殺菌中起主要作用，而高壓電場的作用可以忽略。顧春英等[15]研究發現，等離子體臭氧對大腸桿菌的殺滅機理主要是作用于細胞壁和細胞膜。有研究表明，在大氣壓下的等離子體中，紫外光子產生又重新復合，難以到達處理的表面，因此紫外線并不對滅菌起作用[16-18]。低溫等離子體殺菌機理的多種假說可能是由于低溫等離子體種類的不同所致，這尚需針對某一類型等離子體單獨進行研究。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
大腸桿菌(Escherichia coli，E. coli)ATCC 10536、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S. aureus) ATCC 12600、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，L. monocytogenes)ATCC 19114、宋內氏志賀氏菌(Shigella sonnei，S. sonnei)ATCC 25931 美國模式培養物集存庫;黃曲霉菌(Aspergillus flavus， A. flavus)CGMCC 3.6434、白色念珠菌(Candida albicans，C. albicans)CGMCC 2.4159 中國普通微生物菌種保藏管理中心。
細菌從-70 ℃接種到營養肉湯中，36.5 ℃培養 18～24 h，備用。A. flavus CGMCC 3.6434劃線接種于孟加拉紅瓊脂平板，28 ℃培養5 d，C. albicans CGMCC 2.4159接種于YPD培養基，28 ℃培養18～24 h，備用。
三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸 美國Sigma公司;細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生物技術有限公司;計數瓊脂、YPD培養基、孟加拉紅瓊脂培養基、營養肉湯 北京陸橋技術有限責任公司;瓊脂糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉等試劑均為國產分析純。
1.2 儀器與設備
輝光放電低溫等離子體殺菌設備(自制，交流輸出，0～10 kV，峰值功率120 W，工作頻率30～40 kHz，通過在電路中加入限流電阻維持輝光放電)。
核酸蛋白分析儀、核酸電泳儀 美國Bio-Rad公司;掃描電鏡、透射電鏡 日本JEOL公司;Tektronix TDS 1002示波器 美國泰克公司;CR22GⅢ離心機日本日立公司;恒溫恒濕培養箱、干燥箱 美國3M公司。
1.3 方法
1.3.1 殺菌動力學曲線的繪制
1.3.1.1 菌懸液的制備
分別吸取E. coli、S. aureus、L. monocytogenes、 S. sonnei肉湯培養液1 mL于1.5 mL離心管中，無菌生理鹽水充分洗滌后，用核酸蛋白分析儀測定細胞濃度，并調整細胞濃度至107 CFU/mL。
用接種環從孟加拉紅瓊脂平板上刮取A. flavus菌絲，轉入盛有1 mL無菌生理鹽水的1.5 mL離心管中，用移液器充分吹打。吸取C. albicans YPD培養液1 mL于1.5 mL 離心管中，無菌生理鹽水充分洗滌并調整細胞濃度至 106 CFU/mL。
1.3.1.2 涂片
吸取E. coli菌懸液10 μL于一無菌載玻片上，均勻涂開。設置1、1.5、2、3、4 min 5 個殺菌處理時間，每個處理時間分別制作6 個涂片，3 個用于滅菌，3 個用作對照。S. sonnei處理方法同E. coli。
S. aureus、L. monocytogenes涂片制備方法同E. coli。設置1、2、2.5、3、4 min 5 個殺菌處理時間，涂片處理方法同E. coli。
A. flavus、C. albicans涂片制備方法同E. coli。設置 5、8、10、12、15 min 5 個殺菌處理時間，涂片處理方法同E. coli。
1.3.1.3 殺菌
打開氣瓶閥門，待放電氣體氬氣充滿整個氣體管路并將滅菌腔室中的空氣排凈，接通高壓電源開始放電產生刷狀低溫等離子體射流。調整放電參數為：峰值電壓 10 kV，工作頻率30～40 kHz，峰值功率120 W，氣體流量2 L/min，氣壓為常壓，溫度為室溫。通過控制電壓和氣體流量保證放電裝置持續放電產生等離子體。待低溫等離子體充滿整個滅菌腔室后，將各菌涂片置于滅菌室載物臺上，載物臺高度距離放電端口6 cm。對照于室溫條件下放置同樣時間。
1.3.1.4 滅菌效果檢測
將處理組和對照組載玻片分別放于無菌培養皿中，加入20 mL無菌生理鹽水將菌體全部洗下。然后吸取50 μL菌懸液涂布于營養瓊脂平板上，36.5 ℃培養18～24 h，采用平板計數法計數存活的菌體數量。 A. flavus和C. albicans涂布于孟加拉紅瓊脂平板上，28 ℃ 培養5 d后進行計數。
1.3.2 輝光放電低溫等離子體的殺菌機理實驗
1.3.2.1 菌懸液的制備
制備E. coli和S. aureus 2 種菌懸液，方法同1.3.1.1節。最后調整菌液濃度至109 CFU/mL。
1.3.2.2 涂片
吸取E. coli、S. aureus菌懸液100 μL滴于無菌載玻片上，均勻涂開。每種菌分別制作3 個涂片。
1.3.2.3 殺菌
滅菌方法同1.3.2.3節。E. coli、S. aureus均處理4 min。
1.3.2.4 掃描電鏡觀察
將2 種菌經殺滅處理后的涂片各一片放于無菌培養皿中，加入1.5 mL 25 mL/L的戊二醛固定液(固定液內舍有0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液、40 g/L多聚甲醛)進行充分清洗，使細菌完全脫離載玻片。然后將菌懸液轉入離心管中，4 ℃固定2 h。0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液浸洗30 min， 10 mL/L四氧化鋨固定液4 ℃后固定2 h(固定液內含有 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液)，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液浸洗 10 min，用30%乙醇10 min，50%乙醇10 min，70%乙醇10 min，90%乙醇10 min(2 次)，100%乙醇10 min (3 次)梯度脫水，醋酸戊酯置換10 min，臨界點干燥、噴金，掃描電鏡下觀察、拍照。未經殺滅處理的對照樣本作同樣處理。
1.3.2.5 透射電鏡觀察
將2 種菌經殺滅處理后的涂片各一片放于無菌培養皿中，加入1.5 mL 25 mL/L的戊二醛固定液清洗后，轉入離心管中4 ℃固定2 h，后續處理同掃描電鏡觀察。乙醇梯度脫水后，環氧丙烷置換10 min，環氧樹脂Epon 812浸透、包埋，聚合后作半超薄切片，美蘭染色后光學顯微鏡下定位，進行超薄切片50～70 nm，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，透射電鏡下觀察、拍照。未經殺滅處理的對照樣本作同樣處理。
1.3.2.6 DNA電泳
將2 種菌經殺滅處理后的涂片各一片放于無菌培養皿中，加入1.5 mL無菌生理鹽水將細菌完全洗下，然后將菌懸液轉入離心管中。
E. coli、S. aureus的DNA提取根據細菌總DNA提取試劑盒進行。取1 µL DNA樣品，0.5%瓊脂糖凝膠，120 V電泳 45 min。溴化乙錠染色，紫外凝膠成像系統觀察檢測 DNA的完整性。
1.3.2.7 光譜采集
控制輝光放電低溫等離子體殺菌設備放電，放電設置及參數同1.3.1.3節。待低溫等離子體充滿整個滅菌腔室后，打開滅菌腔，將示波器探頭對準并靠近等離子體噴射口采集等離子體激發光譜。
2 結果與分析
2.1 6 種微生物的殺菌動力學曲線
殺菌處理后的菌體細胞經培養后，記錄平板上的活菌數，以殺菌時間為橫坐標，活菌數為縱坐標，繪制6 種微生物的殺菌動力學曲線。由圖1可知，研制的輝光放電低溫等離子體殺菌設備可以對6 種微生物實現快速、有效殺滅。從殺菌速率上看，E. coli和S. sonnei最快被殺滅，在殺菌處理1 min時，細菌存活數已明顯減少;從徹底殺滅微生物所需時間上看，E. coli和S. sonnei所需時間最短，分別只需要2 min和1.5 min，S. aureus需要3 min， L. monocytogenes需要4 min，A. flavus和C. albicans均需要10 min;從殺菌動力學曲線形狀看，E. coli和S. sonnei 的曲線形狀相似，S. aureus和L. monocytogenes相似， A. flavus和C. albicans屬于一類，各種菌的殺菌動力學曲線將6 種微生物準確的分為革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌和真菌3 類。
2.2 輝光放電低溫等離子體的殺菌機理
2.2.1 掃描電鏡結果
經掃描電鏡觀察發現，在10 000和30 000 倍電鏡視野下，等離子體處理前，玻片表面的細菌分布均勻，細菌表面光滑，邊界完整，形態飽滿(圖2A、2C)。經輝光放電低溫等離子體處理后，可見細菌胞壁和胞膜破裂，胞質外溢，細胞皺縮，失去原有形態，有的僅殘存一些細胞碎片(圖2B、2D)。
2.2.2 透射電鏡結果
經透射電鏡觀察發現，正常的大腸桿菌呈桿狀，金黃色葡萄球菌呈球形，細胞壁及細胞膜結構完整，細胞壁結構極明顯，電子密度較高，胞漿內電子密度均一(圖3A、3C)。經輝光放電低溫等離子體處理后，細菌細胞壁和胞漿內電子密度都降低。有的菌體細胞壁及細胞膜斷裂，核心溶解，菌體近似空殼(圖3B、3D)。
2.2.3 核酸電泳結果
對細菌基因組DNA電泳結果顯示，經輝光放電低溫等離子體處理細菌的核酸和對照核酸大小一致，且帶型完整，沒有拖尾現象(圖4)。初步推測輝光放電低溫等離子體處理未對細菌的核酸造成明顯破壞。
2.2.4 光譜分析
由圖5可知，低溫等離子體在700～1 000 nm波長范圍內對氬氣有較大激發，主要為可見光和近紅外光線，在300～400 nm波長范圍內有微弱激發，主要為紫外線，可能與滅菌腔體中的少量空氣有關。由光譜分析結果可以說明低溫等離子體激發氬氣產生的幾種射線不是導致細菌死亡的主要原因。
3 討 論
在設備研制方面，由于大氣壓下的輝光放電極易向電弧放電轉化，大氣壓下輝光放電等離子體的產生及維持非常困難。目前維持大氣壓下輝光放電的方法主要有 3 種，分別是串聯電阻、介質阻擋、短脈沖驅動[19-20]。本實驗通過在電路中加入限流電阻的形式來維持輝光放電，解決了大氣壓下的輝光放電問題，從而保證了放電等離子體的“低溫”。
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從6 種微生物的殺菌動力學曲線來看，各種菌的殺滅時間有所不同，分析原因可能與微生物的細胞壁結構有關。細胞壁越厚，擊碎或是穿透細胞壁需要的時間越長。革蘭氏陰性細菌細胞壁的厚度約為2 nm，革蘭氏陽性細菌細胞壁厚度為15～18 nm[21]，而真菌細胞壁的厚度則達到100～200 nm。細胞壁的厚度恰好與微生物的殺滅時間呈正相關。本實驗提供了一個應用低溫等離子體技術進行殺菌的新思路，即通過對各類微生物進行殺菌動力學研究，總結歸納出各類微生物的殺滅規律，便可得到針對大多數微生物的廣譜滅菌參數。比如，若對一般的細菌進行殺菌，需要4～5 min即可;若對真菌進行殺菌，則需要10 min左右。這將為輝光放電低溫等離子體殺菌技術廣泛用于微生物殺菌提供重要的方法依據，從而有助于推動低溫等離子體技術在殺菌領域特別是食品殺菌領域的推廣應用。當然，微生物往往借助于各種 “寄主”生存。因此，在實際應用中，必須考慮微生物生存基質對殺菌效果的影響，這是低溫等離子體殺菌技術需要重點研究和解決的問題。
低溫等離子體滅菌機制包括等離子體物理和細胞分子生物學兩個方面。從等離子體物理方面來講，由于低溫等離子體成分復雜，其中有殺菌作用的成分有帶電粒子(離子和電子)、紫外線、ROS以及射線，這與放電氣體和放電方式有關。故究竟哪種成分起主要作用，目前尚存在爭議。從細胞分子生物學方面來講，需要確定等離子體破壞微生物細胞的具體位點，比如細胞壁、細胞膜、細胞中的蛋白質、酶、亞細胞器以及DNA等都有可能是等離子體的作用靶點，而低溫等離子體究竟破壞了微生物細胞內哪些組分而導致微生物死亡，目前也不十分清楚。本研究從等離子體物理和細胞分子生物學兩方面探討了輝光放電氬氣低溫等離子體對微生物的殺滅機制。對氬氣等離子體的光譜分析可以說明低溫等離子體激發氬氣產生的幾種射線不是導致細菌死亡的主要原因，這與Moisan等[22]的研究結論一致。張劍等[23]也證明了過氧化氫等離子體殺滅芽孢桿菌過程中，紫外線并不起主要作用。另外，核酸電泳結果說明低溫等離子體并未造成菌體 DNA的明顯斷裂，也進一步說明紫外線并不是殺死細菌的主要原因。掃描電鏡和透射電鏡觀察結果顯示，低溫等離子體明顯破壞了細菌的外部結構(細胞壁和細胞膜)，這與張燦等[24]的研究結果一致。因為本實驗采用氬氣作為放電氣體，所以不存在ROS的氧化作用。因此，這可能是低溫等離子體中的帶電粒子的擊穿作用所致。綜上分析，初步得出氬氣低溫等離子體可能是通過帶電的高能粒子對細菌的細胞壁造成破壞，進而殺死細菌的結論。至于低溫等離子體是怎樣破壞細菌的外部結構，比如是否破壞了細胞壁中肽聚糖結構，是否將蛋白質分解成小分子的多肽片段等，目前并不清楚，還需進一步研究。
輝光放電低溫等離子體殺菌技術克服了熱力、化學及輻照等方法中的不足，將具有較大的應用前景和研究價值。未來對該技術的研究重點應放在：1)加強低溫等離子體的應用研究特別是在食品殺菌領域的應用研究; 2)研究低溫等離子體殺菌技術與其他殺菌方法結合使用的效果，結合多種殺菌方法優勢，開發新型殺菌設備; 3)繼續深入研究各種低溫等離子體的殺菌機理，為其在食品工業中的應用提供更多理論依據。——論文作者：李兆杰1 ，楊麗君1,*，劉小菁2 ，王 靜1 ，劉玉敏1 ，李春喜1
參考文獻：
[1] 馬挺軍, 史喜成, 賈唱喜. 低溫等離子體在食品殺菌中的研究進展[J]. 農產品加工: 創新版, 2009(6): 8-11.
[2] 倪盈, 陳永昌, 王明連, 等. 低溫等離子體殺菌的實驗研究[J]. 環境工程學報, 2009, 3(11): 1951-1955.
[3] 李蘊. 低溫等離子體滅菌新技術及在食品中的應用[J]. 華東科技: 學術版, 2012(12): 47.
[4] 石興民, 張冠軍, 袁育康, 等. 低溫等離子體對細菌芽孢的滅活研究[J]. 南方醫科大學學報, 2009, 29(10): 2033-2036.
[5] 劉筱娣, 杜寧, 彭磊, 等. 一種低溫等離子體針對變形鏈球菌殺滅效果的研究[J]. 中國消毒學雜志, 2010, 27(4): 373-378.
[6] 林向陽, 黃彬紅, 李雁暉, 等. 低溫等離子體殺滅橙汁S. aureus的研究[J]. 中國農學通報, 2011, 27(5): 439-446.
[7] 鄭自娜, 流云風, 于俊梅. 低溫等離子體滅菌的應用[J]. 中華醫院感染學雜志, 2009, 19(8): 945-946.
[8] LAROUSSI M. Nonthermal decontamination of biological media by atmospheric-pressure plasmas: review, analysis, and prospects[J]. IEEE Transactions on Plasma Science, 2002, 30(4): 1409-1415.
[9] MONTIE C T, KELLY-WINTENBERG K, REECE R J. An overview of research using the one atmosphere uniform glow discharge plasma (OAUGDP) for sterilization of surfaces and materials[J]. IEEE Transactions on Plasma Science, 2000, 28(1): 41-50.
[10] LARONSSI M, LEIPOLD F. Evaluation of the roles of reactive species, heat, and UV radiation in the inactivation of bacterial cells by air plasmas at atmospheric pressure[J]. International Journal of Mass Spectrometry, 2004, 233(1/3): 81-86.
[11] 劉紅霞, 陳杰. 低溫等離子體滅菌研究與應用進展[J]. 現代預防醫學, 2009, 36(14): 2695-2698.
[12] 葉幗嬪, 張茜, 潘紅, 等. 低溫等離子體活性水對致病菌的作用[J]. 中國科學: 生命科學, 2013, 43(8): 679-684.
[13] 石興民, 郝炳華, 袁育康, 等. 氣體等離子體對細菌損傷作用的電鏡觀察[J]. 中國消毒學雜志, 2003, 20(4): 284-286.
[14] 石興民, 張冠軍, 袁育康, 等. 低溫等離子體對白色念珠菌影響的電鏡觀察[J]. 西安交通大學學報: 醫學版, 2009, 30(6): 775-776.
[15] 顧春英, 薛廣波, 居喜娟. 等離子體臭氧對大腸桿菌的殺滅機理研究[J]. 現代預防醫學, 2004, 31(1): 33-35.
[16] DENG X T, SHI J J, KONG M G. Physical mechanisms of inactivation of Bacillus subtilis spores using cold atmospheric plasmas[J]. IEEE Transactions on Plasma Science, 2006, 34(4): 1310-1316.
[17] LAROUASI M. Sterilization of contaminated matter with an atmospheric pressure plasma[J]. IEEE Transactions on Plasma Science, 1996, 24(3): 1188-1191.
[18] HERRMANN H W, HENINS I, PARK J, et al. Decontamination of chemical and biological warfare (CBW) agents using an atmospheric pressure plasma jet(APPJ)[J]. Physics of Plasma, 1999, 6(5): 2284-2289.
[19] 盧新培, 嚴萍, 任春生, 等. 大氣壓脈沖放電等離子體的研究現狀與展望[J]. 中國科學: 物理學 力學 天文學, 2011, 41(7): 801-815.
[20] 潘利江, 劉文正, 張德金, 等. 大氣壓輝光放電向弧光放電的轉化特性研究[J]. 電源技術, 2012, 36(6): 885-888.
[21] GAUN L F, BEGGS C B, GEORGHIOU G E. Bactericidal action of the reactive species produced by gas-discharge nonthermal plasma at atmospheric pressure: a review[J]. IEEE Transactions on Plasma Science, 2006, 34(4): 1257-1269.
[22] MOISAN M, BARBEAU J, CREVIER M C, et al. Plasma sterilization methods mechanisms[J]. Pure and Applied Chemistry, 2002, 74(3): 349-358.
[23] 張劍, 史紹毅, 朱亭亭. 過氧化氫擴散和等離子體放電對嗜熱脂肪芽孢殺滅效果比較[J]. 中國消毒學雜志, 2014, 31(7): 677-682.
[24] 張燦, 劉文君, 張明露. 水中細菌的低溫等離子體滅活效果[J]. 環境與健康雜志, 2013, 30(12): 1081-1083.
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