發布時間：2021-05-11所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：從多種來源樣品中分離篩選高產蛋白酶的菌株，為微生物發酵玉米蛋白粉產玉米肽，即玉米蛋白粉的增值及綜合利用提供菌株資源。采用固體篩培法和福林酚法等方法篩選降解玉米蛋白粉的菌株，并在形態及16SrDNA序列分析多樣性的基礎上，鑒定菌株，進行目標菌
摘要：從多種來源樣品中分離篩選高產蛋白酶的菌株，為微生物發酵玉米蛋白粉產玉米肽，即玉米蛋白粉的增值及綜合利用提供菌株資源。采用固體篩培法和福林酚法等方法篩選降解玉米蛋白粉的菌株，并在形態及16SrDNA序列分析多樣性的基礎上，鑒定菌株，進行目標菌株蛋白酶活性和生長特性的研究。結果顯示：獲得分離菌株405株，其中具有蛋白分解能力的目標菌株58株，歸屬于4科，5屬，17種，2個亞種，包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、游動微菌屬(Planomicrobium)等，并以芽孢桿菌屬(Bacillus)豐度最高。目標菌株均能分泌堿性、酸性和中性蛋白酶，菌株堿性蛋白酶活性普遍較高。對8株代表性目標菌株進行了生長特性研究，生長最適溫度一般在30~40℃、最適pH一般在7~9。研究還發現蛋白酶活性及生長特性具有菌株特異性。
關鍵詞：玉米蛋白粉;蛋白酶活性;玉米肽;菌株篩選方法;芽孢桿菌屬
玉米是全世界的主要糧食作物之一，我國播種面積3億畝左右，年產量兩億多噸[1-2]。玉米蛋白粉是玉米淀粉加工生產過程的主要副產物，產量巨大。但由于玉米蛋白粉的水溶性差及直接利用的生物學價值低等原因，嚴重限制了其在食品工業中的應用，大多僅被當作飼料或廢棄物[1-2]。因此開發玉米蛋白粉高效加工利用技術具有重要應用價值。玉米肽是玉米蛋白的水解產物，其具有易消化吸收、抗氧化等優良特性[3-5]。目前利用玉米蛋白制備玉米肽的方法主要包括化學法、酶解法和微生物發酵法[2-3]，微生物發酵法產玉米肽，較之其他產肽方法(酶法和化學法)，能修飾重組苦味基團，減少苦味，同時使玉米肽的抗氧化性、解酒、抗疲勞、降血壓、抗炎、抗癌、抗糖尿病等功能得到更充分的發揮和應用[2,5-7]，是一項具有廣闊應用發展前景的玉米蛋白粉加工技術。我國在生物活性肽尤其在玉米肽研究上起步晚于歐美，但是近些年越來越受到關注和重視[2,5-6]。但微生物發酵玉米蛋白粉產功能肽的研究相比酶法等還處于早期研究階段[2,6,8]，面臨適宜發酵微生物資源及其蛋白酶認識和開發不足、微生物種類較單一以及相應發酵工藝建立等亟待解決的問題。其中，篩選獲得降解玉米蛋白粉能力強和具高效蛋白酶活性的菌株成為微生物發酵生產應用的基礎和關鍵所在。
鑒于此，本研究從多種來源樣品中，利用玉米蛋白粉固體篩培法和福林酚法等技術，分離篩選高蛋白酶活性的菌株;進行菌株鑒定及生長特性的研究，評價這些菌株的蛋白分解能力和可利用性能，為解決和提高微生物發酵玉米蛋白粉的高效微生物資源缺乏及發展應用技術奠定了基礎。
1材料方法
1.1材料
玉米蛋白粉及分離所用傳統發酵食品(酸奶、益生菌飲料、發酵面團等)：市購;菌株基因組提取試劑盒(TIANampBacteriaDNAKit)：北京天根生化科技有限公司;酪蛋白、福林酚：北京索萊寶科技有限公司;配制培養基的各種樣品、試劑，均為國產分析純：國藥集團。
測定蛋白酶活的試劑：無水碳酸鈉溶液、三氯乙酸溶液、磷酸緩沖液(pH分別為4.5、7.2、9.3)。
菌株分離純化采用LB培養基：酵母提取物5.0g、胰蛋白胨10.0g、NaCl10.0g、瓊脂粉20.0g、蒸餾水1.0L、pH7.0~7.5。
菌株篩選采用玉米蛋白粉培養基：玉米蛋白粉30g、KH2PO43.0g、K2HPO42.0g、NH4Cl0.1g、MgSO4·7H2O0.2g、NaCl5.0g、蛋白胨1.5g、牛肉膏0.6g、瓊脂20.0g、蒸餾水1.0L、pH7.0~7.5。
玉米蛋白粉粉碎過100目篩。以上培養基調節pH值后，滅菌條件為121℃，20min。
1.2實驗儀器
pH計，FE20K：瑞士梅特勒–托利多(METTLERTOLEDO)公司;超凈工作臺，DL-CJ-1N：河南兄弟儀器設備有限公司;振蕩培養箱，SHK-99-II：北京北方同正生物技術發展有限公司;微型旋渦儀，V2S02S：德國艾卡(IKA)公司;恒溫水浴鍋，SM-8D：南京舜瑪儀器設備有限公司;酶標儀，SynergvHT，美國伯騰(BIOTEK)公司;臺式高速冷凍離心機，EPPENDORF5810R，德國艾本德(EPPENDORF)公司;PCR儀，C1000Touch：美國伯樂(BIORAD)。
1.3實驗方法
1.3.1菌株分離純化
分離采用傳統平板涂布法。將樣品懸液適當的稀釋，取一定量的稀釋液放在無菌的LB瓊脂平板上，然后用無菌刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養基表面上，30℃恒溫培養，觀察挑取單個菌落。
純化采用平板劃線法。利用無菌接種環取菌株培養物少許在平板上進行劃線。經培養后，劃線上的單個細胞形成純的單菌落。
1.3.2菌株初篩
菌株純化菌液10~20μL接種到玉米蛋白粉平板篩選培養基的無菌濾紙片上或空孔中(直徑均為0.5cm)，放入30℃恒溫培養箱中培養72h，每隔12h觀察測定菌落周圍透明圈的大小。
1.3.3菌株蛋白酶活性測定復篩初篩
后出現水解透明圈的菌株進行復篩。接種待測菌株于LB液體培養基中，在37℃，150r/min條件下振蕩培養后，接種于玉米蛋白粉基礎發酵液培養基中，在37℃，150r/min條件下發酵培養48h后，離心(4000r/min，10min)，取上清液為待測樣品，測定蛋白酶活性。按照福林酚試劑法測定發酵液中上清液的蛋白酶活性(GB/T28715—2012飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定，SB/T10317—1999蛋白酶活力測定法)。
1.3.4序列分析和菌種鑒定
將分離純化后的細菌菌株接種到LB液體培養基中，在37℃，170r/min的條件下振蕩培養48h，再利用細菌基因組試劑盒提取基因組DNA。采取試劑盒抽提得到細菌DNA后，通過PCR擴增16SrDNA，配置50μL的反應體系，細菌16SrDNA引物為27F和1492R。PCR循環程序為：95℃預變性5min，95℃30s，52℃30s，72℃90s，30個循環;72℃延伸10min。擴增得到的細菌PCR產物送至上海生工生物科技有限公司測序，測序的長度在1400bp左右。采用DNAMAN軟件序列圖譜對測序結果進行人工校對拼接，拼接后的序列在NCBI核酸序列數據庫中進行同源序列搜索比對。根據同源序列搜索結果，選取測試菌株關系較近的模式菌株的16SrDNA序列區序列，Bioedit比對后用MEGAX軟件采取ML法構建系統發育樹，可靠性檢驗bootstrap法，初始值1000次。系統發育樹中本研究測得的序列號為MW090728-MW090784，Genbank中下載用于比對分析做系統發育樹的序列有MH997645、MK993455、KY129662、MN227492、MT539148、MT039450、MK629812、MN209912、MN733170、NR_104873、KM234223、FJ613555、MN865799、MK990073、MT457707、NR_042254、MH734924、MN204064。1.3.5菌株生長特性研究生長曲線。采用LB培養基，30℃測定菌株生長曲線。YTSS培養基，每隔4h取樣一次測OD600值。
生長溫度。配置LB培養基，2%接種量，在溫度梯度4~70℃培養，測定菌株生長的溫度范圍及最適生長溫度。
生長pH。配置LB培養基，2%接種量，調配培養基pH2~12，測定菌株生長的pH范圍及最適生長pH。
2結果與討論
2.1樣品菌株分離純化、菌株初篩及菌種鑒定
從各種傳統發酵食品(酸奶、益生菌飲料、發酵面團等樣品中共分離菌株405株，其中通過玉米蛋白粉平板篩選培養基初篩出現透明水解圈菌株58株，透明水解圈一般經過48h培養后根據不同菌株情況陸續出現，部分菌株透明水解圈圖片見圖1，菌株透明圈(H/C)值最大可達4.2，多數在1.5~2.5之間。提取能夠產生透明水解圈菌株的基因組DNA，PCR擴增16srDNA序列，并測序獲得高質量序列信息，通過NCBIBLAST比對確定菌株分類地位。結果顯示篩選獲得的細菌歸屬于4科，5屬，17種，2個亞種。豐度最高為芽孢桿菌屬Bacillus，具體見分類表1。菌株之間的系統發育進化樹見圖2。
目前，常見的產蛋白酶微生物包括枯草芽孢桿菌、米曲霉、黑曲霉等[1,7,9]。微生物發酵菌種的選擇標準一般有菌種繁殖速度快而穩定、分泌酶能力強、耐受性強等[1,2,5,7]。本研究中分離菌株數目最多的為芽孢桿菌。芽孢桿菌既可以產生中性蛋白酶，又可以產堿性蛋白酶[1]，并且被收錄在我國食品目錄上，是比較安全可靠的菌種�？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)，是常見的一種芽孢桿菌，分布廣泛，能夠幫助動物免疫器官發育，提升抗體和免疫球蛋白的水平，增強免疫力，還能夠合成多種維生素類，并能合成脂肪酶、纖維素酶、α-淀粉酶、蛋白酶等酶類[1,5,7,10]。
研究中還發現了地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，該菌亦屬于芽孢桿菌屬。應用價值廣泛，能夠凈化水質、降解毒害物質，調整腸道菌群及腸道功能，也能夠提高生物體免疫力，拮抗病原菌等，并具有較強的蛋白酶、脂肪酶、纖維酶活性[11-12]。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)在農業上有促進植物生長和抵御病原微生物作用，具有廣譜抗菌活性，并且用于開發生物藥劑潛力巨大[13]。乳酸菌廣泛用于乳制品、肉制品、水產品和果蔬產品等發酵，還可產生抑菌活性的代謝產物，作為生物保護菌[14]，本研究也有分離到。
相關期刊推薦：《糧油食品科技》1991年創刊，主要讀者：糧油食品加工企業、糧庫、糧油檢測機構、大專院校和科研設計院所等。設有：糧食加工、油脂加工、營養與品質、質量安全、倉儲物流、糧油食品、生物工程、科技與產業等欄目。
值得注意的是中華游動微菌(Planomicrobiumchinense)最早分離自我國海岸沉積物[15]，本研究分離自發酵海產品，而建立該屬的模式種韓國游動微菌(Planomicrobiumkoreense)，也是分離自韓國傳統發酵海產品[16]，也有該屬種分離自章魚腸道并報道具有蛋白酶活性[17]。
2.2菌株蛋白酶活性測定復篩
篩選得到的58株菌株的堿性、中性、酸性蛋白酶活性測定結果見表2。從研究結果可看出篩選獲得的菌株中性蛋白酶活性和堿性蛋白酶活性普遍高于酸性蛋白酶活性，并且堿性蛋白酶活性普遍較高，一般大于60U/mL，大于90U/mL的有8株，分離到的芽孢桿菌、乳酸菌、游動微菌等都表現出較高的蛋白酶活性，顯示出巨大的堿性蛋白酶資源潛力。
2.3菌株生長特性研究
通過前面的菌株分離純化、初篩和蛋白酶活測定復篩，綜合透明圈大小、酶活高低、菌株種類等因素，選出8株菌株進行了生長特性研究。8株菌的生長曲線見圖3，生長溫度曲線見圖4，生長pH曲線見圖5。生長曲線中(圖3)，菌株的生長可分為兩大類，一類菌株CGM54、CGM40、CGM47、CGM48、CGM8在生長48h左右達到峰值，另一類菌株CGM58、CGM56、CGM34在生長80h左右達到峰值。生長最適溫度一般在30~40℃(圖4)。生長最適pH一般在7~9(圖5)。
本研究中生長特性也表現出菌株特異性，不同菌株間存在顯著差異。細菌的生長繁殖一般包括四個階段，遲緩期、對數期、穩定期和衰亡期。大部分篩選菌株在接種后幾個小時內可進入快速的指數生長期，少數菌株則有緩慢適應生長階段后，再進入指數生長期;培養菌株的指數生長期的持續時間也存在不同。例如CGM34和CGM40，16SrDNA序列比對都鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，但其生長曲線存在較大差異。生長溫度、生長最適溫度、生長pH及生長最適pH等和已報道的同類別菌株基本一致[1,13,15,16]，如中華游動微菌(Planomicrobiumchinense)被報道在10~45℃生長，最適生長溫度為30~35℃，生長pH5~10，生長最適pH6~7[15]。菌株的生長特性研究十分重要，生長特性條件將為后續微生物發酵工藝的優化和生產利用等提供參考和基礎。
3結論
篩選高效降解玉米蛋白粉的微生物菌株，是目前的重要研究領域。本研究分離篩選了高產蛋白酶菌株，從各種樣品中共分離菌株405株，其中通過玉米蛋白粉平板篩選培養基初篩出現透明水解圈菌株58株，確定了菌株的系統分類地位;并結合菌株分離純化、初篩和蛋白酶活測定復篩，綜合透明圈大小、酶活高低、菌株種類等因素，選出8株菌株進行了生長特性研究，菌株一般生長最適溫度一般在30~40℃，生長最適pH一般在7~9。蛋白酶活及生長特性等具有菌株特異性。本研究擴展豐富了后續微生物發酵玉米蛋白粉得到玉米肽的微生物菌株資源及微生物蛋白酶源，增加了微生物種類。后續將利用篩選菌株進行玉米蛋白粉微生物發酵產玉米肽的研究和優化發酵工藝的探索，為玉米蛋白粉的增值和綜合利用提供理論和技術基礎。——論文作者：任菲，劉玉春，王超，郭超
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