發布時間：2021-04-27所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要葉綠素熒光動力學過程與藻類光合作用過程密切相關，葉綠素熒光動力學法是探測活體藻類細胞的天然工具。與常用的壓載水熒光素染色-顯微鏡檢活體藻細胞計數相比，葉綠素熒光動力學法具有測量快速、靈敏度高、無需前處理等特點。海洋船舶壓載水中存在大量死
摘要葉綠素熒光動力學過程與藻類光合作用過程密切相關，葉綠素熒光動力學法是探測活體藻類細胞的天然工具。與常用的壓載水熒光素染色-顯微鏡檢活體藻細胞計數相比，葉綠素熒光動力學法具有測量快速、靈敏度高、無需前處理等特點。海洋船舶壓載水中存在大量死亡藻細胞和有色溶解有機物(CDOM)，熒光背景復雜，因此，獲得不受熒光背景影響且能夠準確表征活體藻細胞數的光合熒光參數，是葉綠素熒光動力學法直接測量壓載水活體藻細胞數的關鍵。本文以死細胞和CDOM溶液模擬壓載水的復雜熒光背景，以二氯苯基二甲脲(DCMU)脅迫條件模擬實際應用，研究了不同熒光背景下Fm、F0、[RCII]和Fv等多個光合熒光參數與活體藻細胞數之間的關系。結果表明：Fm、F0、[RCII]對活體藻細胞數的表征都不同程度地受死細胞數和CDOM濃度的影響，僅有Fv不受熒光背景的影響，相對標準偏差小于5%;在不同稀釋液稀釋活體藻細胞溶液實驗中，Fv與活體藻細胞數均具有良好的線性相關性，相關系數R2可達0.98以上;在DCMU脅迫作用下，有且僅有Fv與活體藻細胞數呈良好的正相關性，相關系數為0.986。本研究結果證明了光合熒光參數Fv不受熒光背景干擾，是表征壓載水中活體藻細胞數的最佳光合熒光參數。
關鍵詞生物光學;壓載水;活體藻細胞數;光合熒光參數;Fv;葉綠素熒光動力學
1引 言
船舶壓載水是有害水生生物和病原體等外來物種傳播最主要的介質之一[1]。為減少壓載水排放造成的外來物種入侵，國際海事組織(IMO)于2004年制定了《國際船舶壓載水和沉積物控制與管理公約》，該公約中的D-2準則[2]規定小于50μm且大于10μm的存活水生生物的準許排放濃度為小于10mL-1，而在這個細胞尺寸范圍內的優勢物種為浮游藻類[3]。目前，國內壓載水活體藻細胞數檢測的主要方法為顯微鏡觀察法，但該方法需要對壓載水進行采樣，再對樣品進行復雜的前處理才可進行后續實驗室鏡檢分析，耗時耗力，且會造成船舶延誤等，因此急需一種對壓載水中活體藻細胞數進行原位快速在線分析的有效方法。
葉綠素a是藻細胞的重要色素之一，大量的研究[4-5]證明葉綠素a的濃度與生物量具有正相關關系。早期常用萃取出的葉綠素a的濃度來表征藻類生物量，但這種檢測方法繁瑣且存在較大誤差。而后，熒光光譜法的問世使得無需提取葉綠素a便可直接快速地測量其濃度從而估算出生物量。但是，葉綠素a分子在死亡細胞內保持完整的時間長達兩周[6-7]，所以利用葉綠素a分析法監測壓載水中活體藻細胞數會受環境中熒光背景的嚴重影響，使得監測結果往往比實際值偏高，且監測結果不穩定[8]。葉綠素熒光動力學方法[5]是近些年發展起來的新方法，該方法就是將藻液暗適應數分鐘后進行飽和脈沖光誘導，在此過程中，葉綠素熒光強度先快速上升而后緩慢下降。而這一過程與藻類活體細胞的光合作用密切相關，因此，利用熒光動力學曲線可以快速無損地獲取初始熒光強度F0、最大熒光強度Fm、可變熒光強度Fv、光化學產量Fv/Fm等多種光合熒光參數[9]。First等[5]率先利用基于熒光動力學曲線得到的光合熒光參數F0來表征葉綠素a的濃度，用Fv/Fm來表征生物活性，從而實現了壓載水中活體藻細胞數的監測。該方法可以快速估計樣品中葉綠素a的濃度以及生物體的整體生理狀態，因此Stehouwer等[10]和國際海事組織(IMO)[11]建議將可變熒光測定法作為評估壓載水的工具。但由于不同藻種之間的Fv/Fm存在很大差異[12]，而且水中營養物質匱乏會引起Fv/Fm值的波動[13]，因此該方法選用的光合熒光參數Fv/Fm不一定適用于表征壓載水中活體藻細胞數。而且，壓載水的成分復雜，含有有色可溶性有機物(CDOM)，游離態葉綠素以及葉綠素未分解的死細胞等會產生干擾活體藻細胞測量的背景熒光干擾物質，這些干擾物質是否會影響，以及是如何影響光合熒光參數表征壓載水中活體藻細胞數的，還尚待研究。
本文以杜氏鹽藻為研究對象，通過設置不同濃度的死細胞來模擬壓載水中高濃度死細胞熒光環境，并通過設置不同濃度的CDOM溶液來模擬壓載水中的其他背景熒光環境，從而觀察光合熒光參數Fm、F0、Fv和[RCII]是否受復雜背景熒光的影響。此外，本文還在二氯苯基二甲脲(DCMU)脅迫條件下，驗證了光合熒光參數Fm、F0、Fv和[RCII]對活體藻細胞數表征的有效性。觀察不同實驗條件下樣品中各光合熒光參數的變化規律，篩選可有效表征壓載水中活體藻細胞數的光合熒光參數，可為發展壓載水活體藻細胞數葉綠素熒光動力學在線監測技術提供參考。
2材料與方法
2.1藻種的選擇與培養
本實驗所用藻種均為購于上海光語生物科技有限公司的杜氏鹽藻(GY-H13Dunaliellasalina)，用F/2培養基進行接種。杜氏鹽藻為海洋綠藻，在合適的培養條件下長勢良好，適合實驗室培養與研究。細胞尺寸為12～13μm，滿足國際海事組織D-2排放準則中監測的浮游藻類的尺寸。將接種后的藻液置于MQD-S3R型恒溫搖床培養箱中進行擴大培養，藻樣的培養條件如下：光源為白色冷熒光燈管，設置溫度為(25±1)℃，轉速為120r·min-1，光照強度為120μmol·m-2·s-1，光暗時間比為12h…12h。保證藻液培養3d，以達到高活性狀態[14]。實驗前，將藻液暗適應10min。
2.2光合熒光參數的獲取
通過FastRepetitionRatefluorometer(FRRf)測得不同實驗條件下光強為0時的Fm、F0、Fv和功能吸收截面σPSII，然后利用公式[RCII]∝F0/σPSII[15]計算得到[RCII]。光合熒光參數如表1所示。
2.3活體藻細胞數的測量
熒光素二乙酸酯(FDA)和5-氯甲基熒光素二乙酸酯(CMFDA)都是膜滲透性染料，本身無熒光，但它們一旦進入到活體細胞內，非特異性酯酶就會裂解染色劑的分子，從而產生不可滲透的熒光產物，在藍光激發下可觀察到綠色熒光。由于FDA和CMFDA具有相似的發射光譜，因此可以同時使用以增強活體細胞所發出的綠色熒光的穩定性[16]。
配制FDA儲存液：取0.1gFDA粉末溶于5mL二甲基亞砜(DMSO)中，配制成濃度為50mmol·L-1的FDA準備液;取20μLFDA準備液，將其溶于980μLDMSO中，配制成濃度為1mmol·L-1的FDA儲存液[17]。
配制CMFDA儲存液：取50μgCMFDA溶于430μLDMSO中，配制成濃度為250μmol·L-1的CMFDA儲存液[17]。
取1mL杜氏鹽藻樣品，向其中加入5μL濃度為1mmol·L-1的FDA和10μL濃度為250μmol·L-1的CMFDA，混合均勻，最終工作濃度分別為5μmol·L-1和2.5μmol·L-1[16]，避光染色10min。使用0.1mL浮游生物計數框、正置熒光顯微鏡(NikonNi-U)進行計數。
2.4CDOM溶液的獲取
CDOM溶液來自實驗室培養2個月以上的藻類混合液的過濾液。使用0.2μm混合纖維脂膜進行過濾，過濾兩次，以確保所有藻細胞均被濾除。
3結果與討論
3.1死細胞熒光干擾下光合熒光參數測量結果分析
為了研究壓載水艙中含有的大量死亡藻類細胞是否會對光合熒光參數定量活體藻細胞數有影響，本文通過配制不同濃度的死細胞液來模擬壓載水艙環境。將藻液于50℃水浴加熱30min，得到死細胞液。用海水將死細胞液稀釋成5個濃度梯度(2、4、8、16、32倍稀釋)且體積相同的死細胞樣品，然后將死細胞樣品分別加入到活體藻細胞數相同的5個杜氏鹽藻樣品中，另設置一個加入相同體積海水的對照樣，觀察Fm、F0、Fv及[RCII]數值的變化。結果如圖1所示，Fm、F0以及[RCII]都隨著死細胞數的增多而呈上升趨勢，有且僅有Fv不受死細胞的干擾，穩定在2.25～2.75之間。Fm、F0、[RCII]數值的相對標準偏差分別為135.58%、47.89%和48.07%，而Fv的相對標準偏差為4.83%，說明Fv的數值基本不隨死細胞數的變化而變化，而Fm、F0、[RCII]數值波動較大。
3.2CDOM熒光干擾下光合熒光參數測量結果分析
壓載水中CDOM等熒光物質的含量極高[18]，本文通過控制藻濾液的濃度來模擬壓載水中CDOM濃度的變化，通過觀察光合熒光參數的變化來判斷光合熒光參數是否受CDOM濃度的影響。柳先平等[19]發現當CDOM的質量濃度低于75mg·L-1時，可以用水溶液的熒光峰強度(λex/λem=320/410nm)表示CDOM濃度。據此，本文采用F-7000熒光分光光度計測定藻濾液的熒光強度，進而計算得到藻濾液的CDOM濃度。將用海水稀釋的5個濃度梯度且體積相同的CDOM溶液樣品加入到活體藻細胞數相同的5個杜氏鹽藻樣品中，同樣設置一個對照樣并加入體積相同的海水。結果如圖2所示，Fm、F0和[RCII]都隨著CDOM濃度的升高而呈上升趨勢，有且僅有Fv不受CDOM濃度升高的影響，保持在1.6附近。Fm、F0和[RCII]的相對標準偏差分別為26.01%、37.86%和37.06%，而Fv的相對標準偏差為1.84%，這說明Fv的波動范圍最小，不受CDOM濃度的影響，而Fm、F0和[RCII]的波動幅度較大，受CDOM濃度的影響比較顯著。
3.3不同稀釋液下光合熒光參數對活體藻細胞數的定量結果分析
為了探究在壓載水艙的復雜熒光環境下，光合熒光參數能否準確定量活體藻細胞數，本文用隨機濃度的死細胞液、CDOM溶液以及二者的隨機混合液來稀釋活體藻細胞原液，觀察活體藻細胞數呈梯度減小的情況下，哪個光合熒光參數能夠精準定量活體藻細胞數。
分別以死細胞液、CDOM溶液以及二者隨機混合液為稀釋液將杜氏鹽藻活細胞原液按比例進行稀釋，稀釋倍數分別為0、2、4、8、16，同樣設置一組以海水為稀釋液的對照組。結果表明：在背景干擾為零的情況下，Fm、F0、Fv和[RCII]都隨活體藻細胞數的減少而下降，如圖3(a)、(b)、(d)所示;與用海水稀釋的杜氏鹽藻樣品的Fm、F0和[RCII]數值相比，用死細胞液和CDOM溶液稀釋的杜氏鹽藻樣品的Fm、F0和[RCII]數值都顯著上升，且Fm和F0隨著活體藻細胞數減少而呈現上升趨勢。如圖3(c)所示，無論用何種溶液稀釋，Fv不受死細胞和CDOM等熒光物質的影響，始終保持著隨活體藻細胞數梯度減小而下降的趨勢。
由圖4所示的T檢驗結果可以看出：無論用何種溶液稀釋得到的Fv值與用海水稀釋得到的Fv的值之間不存在顯著性差異，P值均大于0.05;而采用含有背景熒光的稀釋液稀釋的樣品的Fm、F0、[RCII]與采用海水稀釋得到的相應值之間存在顯著性差異，P值均小于0.05。
由表2所示的相關性分析可知：當用海水稀釋時，所有光合熒光參數都與活體藻細胞數有著良好的相關性，能夠定量活體藻細胞數，甚至，Fm、F0和[RCII]對活體藻細胞數的定量更優于Fv對活體藻細胞數的定量;但當樣品中存在大量死細胞和CDOM時，只有Fv和活體藻細胞數呈現出良好的正相關，能夠定量活體藻細胞數。定量結果如圖5所示，除去箭頭指向的點以外，Fv與活體藻細胞數之間的線性關系穩定，線性關系式為y=0.002x-0.102(R2=0.983)，而Fm、F0以及[RCII]均因受死細胞和CDOM的影響而與活體藻細胞數無明顯的線性關系。不同稀釋液對線性關系式的影響不大，Fv能夠精準定量活體藻細胞數。考慮到箭頭指向點后，Fv與活體藻細胞數之間的線性關系不穩定，這是包裝效應導致的[20]。包裝效應會增加PSII熒光產生的光子在離開細胞之前的吸收，從而使得光合熒光參數的測量值相應降低。
3.4在DCMU脅迫作用下光合熒光參數隨活體藻細胞數的變化規律
為了進一步驗證光合熒光參數對活體藻細胞數的表征，在6個25mL杜氏鹽藻原液樣品中分別加入1mL質量濃度分別為5，10，20，40，50μg·L-1的DCMU樣品，并配制對照樣(加入1mL海水)，靜置10min后測量其光合熒光參數。由圖6可以看出，隨著DCMU濃度增大，活體藻細胞數減少，Fv隨著活體藻細胞數的減少而降低，而其他參數則隨著活體藻細胞數的減少而增大，有且僅有Fv與活體藻細胞數呈現出相同的變化趨勢。
如表3所示，Fv與活體藻細胞數有很強的正相關性，而其他參數則與活體藻細胞數呈現出負相關性。Fm、F0和[RCII]出現反常(隨著活體藻細胞數的減少而增大)的原因是當PSII抑制劑(DCMU)不可逆地阻斷一小部分反應中心時，隨著熒光強度的增加，能量被重定向到另一個反應中心，并且能量直接重發射的概率增加，導致Fm和F0增大[21]。同時，DCMU阻斷了一小部分反應中心導致σPSII下降，而F0上升，所以[RCII]也隨著熒光強度的增加而增大。——論文作者：華卉1，2，3，殷高方1，3*，趙南京1，3**，甘婷婷1，3，陳敏1，2，3，王璐1，2，3，亓培龍1，2，3，王翔1，2，3，張小玲4，方麗1，3，楊瑞芳1，3，董鳴1，2，3，陳志浩1，2，3，賈仁慶1，2，3，丁志超1，2，3，劉建國1，3
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