發布時間：2021-04-26所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：腎俞、足三里為針刺治療骨質疏松癥的常用穴位，但其具體機制尚不明確。目的：基于骨組織Runt相關轉錄因子2啟動子甲基化水平，探究電針腎俞、足三里等穴位對去卵巢骨質疏松癥大鼠的療效機制。方法：將50只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、電針穴位
摘要背景：腎俞、足三里為針刺治療骨質疏松癥的常用穴位，但其具體機制尚不明確。目的：基于骨組織Runt相關轉錄因子2啟動子甲基化水平，探究電針腎俞、足三里等穴位對去卵巢骨質疏松癥大鼠的療效機制。方法：將50只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、電針穴位組、電針非穴位組、雌二醇組，每組10只。假手術組以外的4組大鼠采用去卵巢法建立骨質疏松癥模型，電針穴位組選取腎俞、足三里穴位進行電針治療，電針非穴位組選取非穴位處進行干預，其余3組不進行電針干預;雌二醇組給予雌二醇片(0.09mg/kg)灌胃治療，假手術組和模型組均灌胃10mL/kg的生理鹽水。干預12周后，測定各組大鼠右側下肢股骨及椎骨骨密度、股骨生物力學性能、血清骨鈣與Ⅰ型原膠原N端前肽表達水平、骨組織骨橋蛋白與骨唾液蛋白表達水平、骨組織Runt相關轉錄因子2啟動子甲基化表達水平。結果與結論：①與假手術組相比，模型組大鼠股骨、椎骨骨密度明顯下降(P<0.05);股骨最大載荷、剛度及彈性模量、血清骨鈣、Ⅰ型原膠原N端前肽水平均明顯下降(P<0.01);骨組織中骨橋蛋白和骨唾液蛋白、Runt相關轉錄因子2啟動子CpG1和CpG2、CpG3和CpG4.5的表達明顯上升(P<0.01);②與模型組相比，電針穴位組和雌二醇組對上述各指標改善明顯(P<0.01);而電針非穴位組骨組織中Runt相關轉錄因子2啟動子CpG1、CpG2、CpG3、CpG4.5的表達下降不明顯(P>0.05)，此外其余上述指標均有所改善(P<0.05);③與雌二醇組相比，電針穴位組對血清Ⅰ型原膠原N端前肽水平的上調較為明顯(P<0.05)，而其余指標差異無顯著性意義(P>0.05);④提示電針腎俞、足三里穴位可通過降低骨組織Runt相關轉錄因子2啟動子甲基化水平，增強骨密度，改善股骨的生物力學性能等，從而有效防治骨質疏松癥。
關鍵詞：電針;骨質疏松;表觀遺傳;甲基化;生物力學;大鼠;Runx2啟動子
0引言Introduction
骨質疏松癥是以患者單位體積內骨量減少為主要特點的代謝性骨病，中老年人為其常見患病群體[1]。作為骨質疏松癥最常見、最嚴重的并發癥，骨質疏松性骨折致殘率高，是造成老年人生活質量下降的主要原因及常見的死亡原因[2-3]。調查顯示，國內65歲以上居民的骨質疏松癥患病率為32%[4]，而絕經后骨質疏松癥占比最大[5]，臨床上對絕經后骨質疏松癥的治療以雌激素替代療法為主，但長期使用會增加女性患乳腺癌、宮頸癌等的概率[6]。
DNA甲基化所屬的表觀遺傳修飾是一種重要的基因表達調控機制，異常的DNA甲基化在癌癥、神經系統疾病、免疫疾病、骨質疏松癥等許多疾病中存在，影響癌癥形成和腫瘤進展[7]�，F有研究表明，Runt相關轉錄因子2(Runtrelatedtranscriptionfactor2，Runx2)基因啟動子甲基化水平的高低是成骨細胞分化和骨形成的重要影響因素，影響骨質疏松癥的發生發展[8-9]。
相關期刊推薦：《中國組織工程研究與臨床康復》1997年創刊，由中華人民共和國衛生部主管，中國康復醫學會與《中國組織工程研究與臨床康復》雜志社主辦。發表組織工程研究中關于干細胞培養與移植、組織構建、材料生物相容性評價(天然或合成材料與納米粒子、人工材料植入體、植入器官及外源性細胞)、計算機輔助骨外科技術的應用基礎及臨床研究，轉化醫學和循證醫學研究的文章，發表中國組織工程研究領域一流水平的學術、技術創新成果。
基于中醫“腎主骨”理論指導，針刺腎俞穴可培腎壯骨，固護人體先天之本，針刺足三里可健脾胃，固護后天之本，從而促進腎精形成[10]。故臨床上通過電針腎俞、足三里穴位將補腎之法廣泛運用于骨質疏松癥的治療中[11]，目前多數研究發現針刺腎俞、足三里等穴位能夠刺激骨密度明顯增加，改善骨骼的生物力學形態[12-13]，但具體機制不甚明確。而研究發現通過針刺腎俞、足三里能促進腰椎中Runx2mRNA表達[10]，由此推測電針腎俞、足三里可能通過影響Runx2基因啟動子甲基化以防治骨質疏松癥。
故此次研究基于骨組織Runx2基因啟動子的甲基化修飾，探究針刺對去卵巢骨質疏松癥大鼠的療效機制。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1設計完全隨機設計，動物實驗，單因素方差分析和LSD檢驗。
1.2時間及地點于2018年12月至2019年12月在廣州中醫藥大學動物實驗中心完成。
1.3材料
1.3.1實驗動物50只成年SD大鼠，SPF級，雌性，體質量160-220g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，動物質量生產合格證號：SCXK(粵)2018-0034。動物房溫度為(21±3)℃，濕度50%。此次實驗已通過廣州中醫藥大學動物實驗中心倫理委員會批準。
1.3.2儀器華佗牌電針儀(型號：SDZ-Ⅱ)，廣東省普寧市普慈醫療器械有限公司;DexaPro-1型雙能X射線骨密度儀，美國GE公司;AllegraX-15R型醫用離心機，美國Beckman公司;JS-Power300型電泳儀，上海迪奧生物科技有限公司;ZF-208型凝膠成像，上海恒勤儀器設備有限公司;PIDRed96型PCR儀，美國ThermoFisherScientific公司。
1.3.3藥品和試劑戊酸雌二醇片(廊坊高博京邦制藥有限公司，批號：20181112，規格：2mg/片);血清骨鈣、Ⅰ型原膠原N端前肽(totalprocollagentype1N-propeptide，P1NP)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，批號：ZN1686238，ZN16730102);水合氯醛溶液(批號：jx-1480);二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(批號：jx-2468);聚丙烯酰胺凝膠試劑盒(批號：jx-2391);羊抗鼠骨橋蛋白一抗(批號：jx-2566);羊抗鼠骨唾液蛋白一抗(批號：jx-2686);甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體(批號：jx-2583);實時熒光定量PCR試劑盒(批號：jx-2465)。
1.4實驗方法
1.4.1動物分組、造模選擇50只6月齡健康雌性SD大鼠，經1周的適應性喂養后，按隨機數字表法分為5組，即假手術組、模型組、電針穴位組、電針非穴位組及雌二醇組，每組10只。假手術組以外的其余4組大鼠采用去卵巢法建立骨質疏松癥模型[14]，麻醉后，在大鼠腰椎旁開1cm處，沿皮膚及肌肉縱向剖離1.5cm左右深度，在脂肪團中找到并切除雙側卵巢;假手術組采用同樣的手術操作暴露但不摘除卵巢。5組大鼠術后每日均予腹腔注射10×104U青霉素，連續給藥3d，防止感染。
1.4.2干預方法正常飼養術后大鼠，2個月后開始進行干預，連續干預12周。電針穴位組固定大鼠并進行常規消毒，參照《實驗針灸學》選取腎俞、足三里穴位[15]，用0.35mm×25mm毫針平刺4.0-5.0mm后，連接電針儀，進行治療，頻率為2Hz，強度為1mA，連續波，每日早晚各1次，每次持續10min;電針非穴位組選取非穴位處(脅下髂嵴上20-25mm，后正中線旁開20mm處)，操作同電針穴位組;其余3組不進行電針干預，但予相同的固定操作。雌二醇組給予雌二醇片(0.09mg/kg)灌胃治療[16]，1次d，給藥12周;假手術組和模型組均灌胃10mL/kg的生理鹽水，1次/d，給藥12周。
1.5主要觀察指標
1.5.1骨密度末次給藥結束后24h，注射10%水合氯醛(3mL/kg)至腹腔，麻醉大鼠后，將大鼠右股骨、椎骨部位置于雙能X射線密度儀器上檢測骨密度。
1.5.2股骨生物力學性能將大鼠麻醉后斷頭處死，取各組大鼠完整的股骨，放置于生物力學萬能實驗機上，機器以2mm/min速度往下壓，直至股骨斷裂。采集數據，測得最大載荷、股骨剛度、彈性模量的數值。
1.5.3血清骨鈣、P1NP的水平從大鼠的腹主動脈收集血液5mL，放置1h，以3000r/min離心10min，分離得到血清。按ELISA試劑盒說明書操作，檢測血清中骨鈣、P1NP的表達水平。
1.5.4骨組織骨橋蛋白、骨唾液蛋白大鼠處死后，取右側股骨洗凈，取部分骨片研磨、提取蛋白，用二喹啉甲酸蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品加到聚丙烯酰胺凝膠的孔內，每孔20μL，用280mA電流轉膜1h。取出PVDF膜，TBST洗3次，5min/次，之后將膜放入5%的脫脂奶粉中，室溫條件下封閉保存2h。封閉結束后，將膜取出，TBST浸洗3次，5min/次，加入骨橋蛋白、骨唾液蛋白的一抗(1∶1000)稀釋液，4℃儲存，過夜。加入二抗(稀釋度為1∶200)，以ECL試劑盒顯色后，置于凝膠成像系統上成像并采用ImageJv1.5.1軟件分析，以相應蛋白與內參(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)的灰度值比值表示該蛋白的相對表達量。
1.5.5Runx2啟動子甲基化水平取雙側股骨頭，除雜、清洗并干燥后，裝入液氮凍存管，擰緊管蓋，液氮速凍0.5h后，于-80℃冰箱中凍存。質譜法檢測：①引物設計：檢測部位為Runx2基因啟動子CpG1、CpG2、CpG3和CpG4.5(表1)。②引物設計完成后，再經過DNA提取(使用QIAGEN試劑盒提取骨組織DNA)、重亞硫酸鹽處理、PCR擴增、堿性磷酸酶處理、體外轉錄(IVT)和RNase酶切、純化，點樣及質譜。
1.6統計學分析
運用統計學軟件SPSS23.0對數據進行分析。以x-±s表示符合正態分布的計量資料，用單因素方差分析(OneWayANOVA)比較各組數據，組間兩兩比較則采用LSD檢驗。P<0.05表明差異有顯著性意義。
2結果Results
2.1實驗動物數量分析健康雌性SD大鼠共50只，隨機分為5組，每組10只，實驗過程中各組大鼠均無死亡。
2.2電針對骨質疏松大鼠股骨、椎骨骨密度的影響在大鼠股骨、椎骨骨密度方面，模型組顯著低于假手術組(P<0.05);與模型組相比，電針非穴位組大鼠的股骨、椎骨骨密度顯著升高(P<0.05)，而電針穴位組和雌二醇組升高更加明顯(P<0.01)，但兩組間比較差異無顯著性意義(P>0.05)，見表2。
2.3電針對骨質疏松大鼠生物力學性能的影響由表3可知，在股骨最大載荷、股骨剛度、彈性模量方面，模型組顯著低于假手術組(P<0.01)，表明造模成功。與模型組比較，電針非穴位組股骨最大載荷、股骨剛度、彈性模量顯著升高(P<0.05)，而電針穴位組和雌二醇組升高更加明顯(P<0.01)。與電針非穴位組比較，電針穴位組和雌二醇組的股骨最大載荷、股骨剛度、彈性模量升高明顯(P<0.05)。表明經過電針干預后，療效明顯。
2.4電針對骨質疏松大鼠骨鈣、P1NP表達的影響在血清骨鈣水平上，模型組顯著低于假手術組(P<0.01);與模型組比較，電針非穴位組的表達升高(P<0.05)，電針穴位組和雌二醇組的表達升高更加明顯(P<0.01)。與電針非穴位組比較，電針穴位組和雌二醇組的表達升高(P<0.05)，詳見表4。
在P1NP表達方面，模型組顯著低于假手術組(P<0.01);與模型組比較，電針非穴位組的表達升高(P<0.05)，電針穴位組和雌二醇組的表達升高更加明顯(P<0.01)。與電針非穴位組比較，電針穴位組的表達升高(P<0.05)。和雌二醇組相比，電針穴位組升高更加明顯(P<0.05)，詳見表4。
2.5電針對骨質疏松大鼠骨橋蛋白、骨唾液蛋白表達的影響由表5及圖1可知，在骨橋蛋白、骨唾液蛋白表達方面，模型組顯著高于假手術組(P<0.01)，表明造模成功。與模型組比較，電針非穴位組的表達降低明顯(P<0.05)，而電針穴位組和雌二醇組降低更加明顯(P<0.01)。表明經過電針干預后，療效明顯。
2.6電針對骨質疏松大鼠Runx2啟動子CpG1、CpG2、CpG3和CpG4.5表達的影響詳見表6。
由表6可見，在Runx2啟動子CpG1、CpG2、CpG3和CpG4.5表達方面，模型組顯著高于假手術組(P<0.01);與模型組比較，電針非穴位組的表達下降不明顯(P>0.05)，電針穴位組和雌二醇組下降明顯(P<0.05)。
3討論Discussion
通過癥狀對比，骨質疏松癥與中醫學中的“骨痹”“骨痿”相似�！端貑�·陰陽應象大論》曰：“腎生骨髓，在體為骨”，腎精、氣虛則骨髓不生，髓減則骨痿，故治療多補腎益精[17]。足太陽膀胱經之腎俞穴，為腎氣輸注于背部之處,針之培腎壯骨，固護人體先天之本�！夺t宗金鑒》曰：“多氣多血惟陽明”，足陽明胃經之足三里，為胃經之下合穴，針之健脾益胃，故針刺足三里能固護后天之本，補益氣血，促精形成[10]。目前研究發現補腎健脾針刺療法對骨質疏松癥患者療效明顯[18]，針刺足三里、腎俞能抑制破骨細胞的骨吸收[19]，增加骨密度、提高骨形成、增強骨強度[13]，通過調節破骨細胞骨吸收與成骨細胞骨的動態平衡，可達到防治骨質疏松癥的目的，但現有研究未闡明其具體機制。
表觀遺傳修飾研究的是基因序列不變，產生可遺傳的基因表達改變，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑、微小RNA(miRNA)等[20]。其中DNA甲基化是在DNA甲基轉移酶的催化下，將甲基基團可逆性轉移到基因組鳥苷酸(CpG)二核苷酸上[21]，啟動子序列DNA甲基化抑制基因表達[22]。間充質干細胞是成骨細胞的來源，研究表明，DNA甲基化能夠調控多種成骨、破骨基因的表達，其中關鍵基因啟動子的甲基化在間充質干細胞在向成骨細胞分化、破骨細胞的過程中起抑制作用，進而影響成骨、破骨細胞的活性與分化，影響成骨的發生發展[23-25]。與此同時，研究表明骨細胞感受機械刺激后亦能抑制間充質干細胞成骨基因甲基化，從而促進成骨細胞分化及骨形成[9]。而作為成骨細胞形成的中心環節，Runx2可調控骨鈣、骨橋蛋白、骨唾液蛋白、Ⅰ型膠原等多種重要成骨細胞表型基因的表達[26-29]�，F有研究表明，去卵巢造成骨組織Runx2啟動子高甲基化，抑制其轉錄，下調其表達，從而下調多種成骨細胞表性基因的表達，導致骨質疏松癥的發生[30]。目前已有研究表明，鹿茸中藥復方、補腎中藥復方、仙靈骨葆膠囊等具有補腎功效的中藥復方能夠降低絕經后骨質疏松癥模型大鼠骨組織的Runx2啟動子甲基化水平，上調Runx2的表達，進而促進成骨[30-31]。
目前基于中藥、針灸防治骨質疏松癥的臨床研究與動物實驗很多，但是明確針對電針腎俞、足三里與Runx2甲基化的研究仍然較少，Runx2作為影響骨質疏松癥發生發展的重要因素[32-37]，電針通過影響其甲基化防治骨質疏松癥的具體作用機制仍待深入研究。
此次研究結果顯示，通過電針具備補腎功效的腎俞、足三里，能夠升高骨質疏松癥模型大鼠骨組織中骨密度，明顯改善股骨最大載荷、剛度及彈性模量，升高血清骨鈣、P1NP的含量，下調骨橋蛋白、骨唾液蛋白及Runx2啟動子CpG1、CpG2、CpG3、CpG4.5的表達，這提示電針腎俞、足三里等穴位可通過降低骨組織Runx2啟動子甲基化水平，促進其轉錄，進而上調其靶基因骨鈣、Ⅰ型膠原等的表達，下調骨橋蛋白、骨唾液蛋白的表達，促進成骨細胞分化，增加骨形成與骨骼骨密度，改善股骨最大載荷、剛度及彈性模量等骨骼生物力學性能，有效降低或延緩骨質疏松癥的發生發展。
此次研究結果中，除血清P1NP水平外，電針穴位組與雌二醇組對其余指標的改善并未見統計學差異，不能作為電針腎俞、足三里穴位能夠較雌二醇更有效防治骨質疏松癥的有力證據，且由于骨代謝中各類細胞分化及相關基因轉錄的復雜性[38]，具體機制仍需進一步研究證明。
綜上所述，電針腎俞、足三里穴位可通過降低骨組織Runx2啟動子甲基化水平，上調Runx2的表達，進而促進骨形成，增加骨骼骨密度，改善股骨的生物力學性能，有效治療骨質疏松癥。提示骨質疏松癥的發病機制之一或為骨組織Runx2啟動子甲基化水平升高;電針腎俞、足三里等穴位或通過降低骨組織Runx2啟動子甲基化水平，有效防治骨質疏松癥。——論文作者：陳趙1，2，莫雨晴3，唐宏宇4
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