RNA聚合酶監視的DNA修復機制

發布時間：2021-04-25所屬分類：農業論文瀏覽：1次

摘 要： 摘要生物體在正常生命過程中面臨內/外因來源的DNA損傷，DNA損傷不僅影響基因正確復制，也阻礙其正常轉錄.為避免DNA損傷帶來的災難性后果，生物體進化出一整套修復機制，以保證復制和轉錄的正確性、基因組的完整性和遺傳的穩定性.本文重點綜述了RNA聚合酶監視

　　摘要生物體在正常生命過程中面臨內/外因來源的DNA損傷，DNA損傷不僅影響基因正確復制，也阻礙其正常轉錄.為避免DNA損傷帶來的災難性后果，生物體進化出一整套修復機制，以保證復制和轉錄的正確性、基因組的完整性和遺傳的穩定性.本文重點綜述了RNA聚合酶監視(RNApolymerase-surveilled,RNAP-S)的DNA修復機制.首先從RNAP結構出發介紹了RNAP對DNA損傷的感知機制;其次討論了滯留RNAP的回溯、與其模板DNA的解離以及后續修復機制的啟動，真核細胞CSB及其泛素化和OGG1介導的RNAP-S修復;最后探討了RNAP-S損傷修復的生物學意義并對其前景進行了展望.

　　關鍵詞RNA聚合酶，DNA損傷，RNAP感知損傷，RNAP-S修復機制1

　　0引言

　　DNA是生物體遺傳物質，其完整性對生命活動的正常運行有著關鍵的作用[1].然而，生物體基本無法避免來自外界和生物體自身內部的DNA損傷，若不及時修復這些損傷，將會對生物體產生災難性的后果[2]：(1)DNA復制(replication)和轉錄(transcription)過程將不能正常進行，嚴重影響了基因組的完整性和穩定性[3];(2)會導致細胞的功能阻礙[1]，細胞癌變[4-6]，死亡[7];(3)也會引發生物體的各種疾病[4].

　　染色體復制過程中的堿基錯配、水解和脫氨基作用是自發性損傷的主要來源[2].DNA損傷的外因來源較多，誘變劑能夠引發烷化、氧化等作用造成突變[8];紫外線誘變形成嘧啶二聚體從而不能配對[9];γ射線、X射線會引起DNA雙鏈的斷裂[8];嵌入劑能引起堿基的插入或缺失[8].面對無法避免的DNA損傷，生物體進化出相應的DNA損傷修復系統來應對這些挑戰.常見的DNA損傷修復方式有：光激活修復、錯配修復、剪切修復，重組修復、跨損修復和非同源末端修復等[2,9](.1)光激活修復系統(photoreactivationrepair,PHR)修復紫外線誘變形成的嘧啶二聚體，被光激活的DNA光解酶斷裂嘧啶二聚體之間的共價鍵而實現直接修復此類DNA損傷[8];(2)錯配修復(mismatchrepair,MMR)用來修復DNA復制過程中的堿基錯配[10].原核細胞MutS、MutL和MutH蛋白通過新復制DNA半甲基化特性識別錯配位點并在其附近切開新鏈、后由UvrD解旋消化產生缺口，再以正確(舊鏈)鏈為模板，由DNA聚合酶和DNA連接酶生成新正確鏈，完成錯配修復[2,10].真核細胞同源蛋白MSH、MLH、PMS通過類似方式完成錯配修復[10];(3)剪切修復(excisionrepair,ER)包括核苷酸切除(nucleotideexcisionrepair,NER)和堿基切除修復(baseexcisionrepair,BER)兩種.大腸桿菌UvrA、UvrB、UvrC和UvrD能夠識別雙螺旋上的扭曲，并切除含有損傷的一小段單鏈片段，后由DNA聚合酶和連接酶修補至正確序列而實施核苷酸切除修復[11].人細胞XPC、XPA、XPD、RPA、XPG和XPF等同源蛋白執行相同的功能[9].在堿基切除修復中，NTHL1、NEIL1或OGG1糖基化酶先切除錯誤堿基，隨后無堿基(apurinic-apyrimidinic,AP)位點內切酶或外切核酸酶切除形成的無堿基戊糖，所形成的缺口由DNA聚合酶和連接酶修復[2].(4)同源重組修復(homologousrecombination,HR)過程可修復雙鏈斷裂(double-strandbreak,DSB)損傷，也修復DNA復制中的錯誤[12].原核細胞DSB修復途徑被稱為RecBCD途徑，參與的重要蛋白有RecA、RecBCD、RecFOR、RuvAB和RuvC[12].真核細胞Rad51、Dcm1、Spo11、MRX、Rad52、Rad59、Rad51c-XRCC3、WRN和BLM完成同源重組修復[9];(5)非同源末端修復(nonhomologousendjoining,NHEJ)是姐妹染色單體形成前的一種修復方式[9].在哺乳動物中，已發現該途徑的相關蛋白有Ku70、Ku80、DNA-PKcs、Artemis和XRCC4等[3,9](.6)跨損DNA合成(translesionsynthesis,TLS)指細胞未能修復損傷時，復制機器繞過受損部位而無模板直接合成DNA鏈的修復機制，可避免染色體的不完全復制[13].原核細胞DNAPolIV(DinB)或DNAPolV[8]，真核細胞REV1、Polδ、Polε、Polκ和Polτ負責跨損合成[2].

　　基因轉錄過程本身也是獨特的DNA損傷修復機制[14].本文重點綜述了轉錄過程中RNA聚合酶(RNApolymerase,RNAP)監視下的修復機制，該機制對DNA損傷的修復有重要的作用，也有利于解決復制和轉錄的沖突，確保正確轉錄物的形成，對生物體的正�；顒佑兄�不容忽視的作用[3,14-16].

　　1RNAP識別DNA損傷并滯留

　　當轉錄中的DNA雙鏈產生誘變損傷時，轉錄模板鏈(templatestrand)的修復程度要高于編碼鏈(codingstrand)[17,18]，模板鏈的修復比編碼鏈的修復更快，而編碼鏈的修復與基因組DNA的修復節奏基本一致，可見轉錄中優先修復模板鏈的DNA損傷[19-21].RNAP沿模板DNA轉錄過程中，會感知DNA損傷，并招募修復蛋白，繼而修復損傷DNA[22]，在此我們稱之為RNAP監視(RNAP-surveilled,RNAP-S)的DNA修復(RNAP-Srepair).RNAP監視的DNA修復不僅存在于活躍轉錄過程，也可見于低水平轉錄過程[20]，而且在進化上是保守的細胞過程[1].

　　1.1RNAP被DNA損傷物理阻止

　　轉錄模板鏈上的DNA損傷，如單鏈斷裂[23]、雙鏈斷裂[24]等會阻礙RNAP在模板鏈上的正常前行.此外，非正規的DNA結構如DNA發夾、RNA:DNA雜合體[25]、莖環結構[26]也會物理障礙性造成RNAP的滯留;同樣，DNA結合蛋白如抑制子[27]、轉錄終止因子Rho蛋白結合在模板DNA上會阻滯RNAP;真核細胞核小體結構也會阻礙轉錄中RNAP的前行[27].的確，數學模型和定量實驗發現，減少LacI路障的占用能明顯增加RNAP的變位(dislodgement)[27];聚丙酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)實驗結果說明RNAP也能被1,N6乙烯基腺嘌呤修飾(1,N6-ethenoadenine,εA)強烈阻礙[28];利用掃描力顯微鏡(scanningforcemicroscopy,SFM)和磁鑷(magnetictweezers,MT)監測RNAP在含有拓撲環結構的DNA鏈上的行進過程，發現DNA環形拓撲結構能有效的阻礙RNAP而干擾轉錄[29].

　　1.2RNAP識別DNA損傷修飾

　　1.2.1三種RNAP的結構功能

　　多亞基蛋白復合體RNAP保守存在于細菌、古細菌、真核生物中，轉錄合成各類RNA，其核心酶(coreenzyme)發揮主要合成作用.最簡單的細菌RNAP核心酶由β、β’、ɑ二聚體、ω亞基構成[30].古細菌核心酶與真核生物RNAPⅡ有顯著的結構保守性[31].真核生物的三種RNAP核心酶結構具有同源性，其中有兩個亞基較為保守，160kDa左右的Rpa1、Rpb1、Rpc1，大約150kDa的Rpa2、Rpb2、Rpc2分別是RNAPⅠ、RNAPⅡ、RNAPⅢ的2個亞基[30].此外，三種RNAP還都具有Rpb5、Rpb6、Rpb8、Rpb10、Rpb12亞基[32].但它們功能存在差別：RNAPⅠ負責合成核糖體RNA(ribosomalRNA,rRNA)[30];RNAPⅡ與信使RNA(messengerRNA,mRNA)、多數小核內RNA(smallnuclearRNA，snRNA)、微小RNA(microRNAs)的合成有關[30];轉運RNA(transferRNA,tRNA)、5SrRNA和一些其它小RNA(smallRNA)由RNAPⅢ合成[30,33](表1).

　　1.2.2RNAPII結構

　　真核生物的多亞基蛋白RNAPⅡ負責轉錄所有編碼蛋白的基因和許多非編碼RNA，也在RNAP-S修復中感知損傷[35].RNAPⅡ幾個重要的結構域：(1)RNAPⅡ的突出結構特征—裂口(cleft)，是一個深的、帶有正電的凹槽，包含活性位點(activesite)、壁(wall)、突出物壁(protrusion)等[36].DNA雙鏈在解鏈前位于裂口的上方，當DNA雙鏈解鏈后模板鏈進入裂口到達活性位點，核糖核苷酸(ribonucleotidetriphosphates,NTPs)從漏斗(funnel)位點處進入;形成的RNA:DNA雜合鏈在靠近活性位點的壁處分離，起始于壁附近的RNA出口通道引導RNA離開;位于裂口DNA出口處的突出物—壁，可能負責模板DNA鏈從RNAPⅡ離開的過程[36].(2)RNAPⅡ的觸發環(triggerloop,TL)和橋螺旋(bridgehelix,BH)是兩個重要的與DNA堿基識別、保真性相關的結構域[36,37].Rpb1亞基上的TL負責磷酸二酯鍵的形成，影響轉錄中NTPs的添加效率[37]，并保持底物特異性[35];在活性位點處添加NTPs時，其構象從開放轉變為關閉從而激活活性[37];BH負責連接RNAPⅡ的兩個部分，將RNAPⅡ催化位點與下游的主、次要通道分開，模板裝載中越過BH的步驟可作為RNAP變位的檢驗點[37].(3)其它結構域例如：夾鉗(clamp)、莖稈(stalk)同樣是RNAPⅡ的重要結構，負責調控裂口的開放、閉合構象[36];舵(rudder)和蓋(lid)是Rpb1結構域的殘基，靠近活性位點，有利于將RNA引導至其出口通道，將DNA引導到壁突起處[36];Rpb1的C-末端結構域(C-terminaldomain,CTD)是調控RNAPⅡ轉錄的中心[38].

　　1.2.3RNAPII識別DNA損傷修飾并滯留

　　RNAPⅡ能識別UV誘導下產生的鏈內交聯損傷[39]、具有輕度螺旋扭曲特性的環丁烷丙胺二丁二聚酯(cyclobutenepyrimidinedimers,CPD)、具有強螺旋扭曲特性的6-4光產物(pyrimidine-pyrimidonephotoproduct,6-4PP)[40,41]、脫氧尿苷、8-氧腺嘌呤(8-oxyadenine,8oA)、8-氧鳥嘌呤(8-oxoguanine,8oG)[23]、胸苷二醇(thymidineglycol,TG)[31]、烷基化損傷[42,43]、無堿基損傷[44]、煙草相關誘變劑產生的鳥嘌呤加合物[4]的損傷、雙鏈斷裂[5,24,25,45]以及DNA發夾、RNA:DNA雜合體等非正規的DNA結構[25].

　　RNAPⅡ在感知DNA損傷時，不與受損的堿基直接發生作用，而是感知其轉錄發生障礙后引起的空間位阻(sterichindrance)[46].裝載DNA模板時，DNA下游模板需要越過橋螺旋(BH)，才能到達活性位點添加NTPs以進行正常轉錄，此跨越步驟(crossing-overstep)需要模板發生顯著的構象變化[37,46].但存在大規模DNA損傷的DNA鏈往往由于受損的堿基與RNAPⅡ的橋螺旋結構上方相結合而不能發生正常的構象變化[35,37,47]，RNAPⅡ無法正常裝載DNA模板鏈，變位步驟受到阻礙因此發生滯留現象[46].CPD，AP部位和5-胍海因(5-guanidinohydantoin,Gh)這幾種損傷引起的DNA損傷構象也都能較為穩定的結合于橋螺旋的上方部位，這是RNAPⅡ的Rpb1亞基中的Arg337與損傷的DNA鏈磷酸基團相互作用的結果，而在正常轉錄過程中，該狀態是短暫存在的[46].DNA堿基胞嘧啶甲基化修飾的中間物5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine,5caC)也與RNAPⅡ的橋螺旋結構上方結合，Rpb2亞基通過Q513殘基，特異性識別5caC，并最終誘導轉錄的停止[35,37](圖1).

　　當遇到較小的損傷如CPD、AP、Gh時，RNAPⅡ雖然受到阻礙，但不足以被滯留[37,46,47].在這種狀態下，RNAPⅡ緩慢的經過損傷位點，并發生不依賴于模板的AMP優先的堿基錯誤摻入，導致轉錄產物mRNA中相對損傷的位點的突變，這種易錯的修復方式(error-pronetranscriptionalbypass)被稱作A規則(A-rule)[37](圖1).形成的含有錯誤堿基的RNA:DNA雜合鏈在穿過雜合鏈通道(hybridbindingchannel)時也會受到嚴重的阻礙，不過在8oA損傷研究中發現這種延伸受阻現象僅出現于損傷后的3nt內，當移動足夠遠時，雜合鏈的任何變形都可以被容忍，以便RNAPⅡ發揮更快的催化作用[31].這種以摻入錯誤堿基選擇繞過損傷的方式也與觸發環結構域閉合狀態相關[46].在原核生物中，也存在易錯修復方式[48,49].此外，不同生物的RNAP應對不同的損傷[31].與噬菌體、細菌、真核生物的RNAP相比，古細菌的RNAP具有更高的敏感度，能識別并滯留在多種損傷處[31](表2).

　　2RNAP監視的DNA損傷修復機制

　　在RNAP監視的DNA損傷修復過程中，滯留的RNAP信號會被轉錄偶聯修復因子識別，RNAP可以從模板鏈解離(dissociated)[50]、回溯變位(backtracked)[51]、降解(degraded)[52]，并引發后續修復蛋白的組裝和修復.

　　2.1滯留RNAP解離和修復啟動

　　細菌中mfd基因的缺失會導致基因突變率下降[53,54]，其編碼的轉錄偶聯修復因子Mfd(mutationfrequencydecline)介導RNAP-S-NER過程[55].Mfd識別并結合轉錄模板鏈上滯留的RNAP，利用其轉位酶活性，使RNAP從DNA模板鏈上解離下來，并招募NER修復因子、DNAPolI、DNA連接酶完成DNA的損傷修復[56](圖2).Mfd具有D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7等多個結構域.N-末端的D1a、D2、D1b組成UvrB的同源組件(UvrBhomologymodule,BHM)，可與UvrA相互作用;D4能與RNAP的β亞基相互作用;D5、D6是馬達結構域，驅動Mfd在DNA上的變位[55];D7與N-末端相互作用，使蛋白處于無活性構象，只有與RNAP相互作用，Mfd才能穩定結合于DNA鏈，發揮移位酶的活性[56,57].

　　“Mfd釋放追趕”模型(releaseandcatch-upmodel)說Mfd可以獨自在裸露的DNA鏈上移位以搜索滯留的轉錄延伸復合物[58]，的確有體內實驗證明Mfd可單獨結合于雙鏈DNA[57].Mfd在DNA鏈上通過轉位酶結構域的TD1、TD2交替步向前移位，但運動速度慢、持續時間短，如果遇到滯留的RNAP，Mfd會與RNAP發生相互作用，并更穩定的與DNA結合[58].單分子實驗驗證了Mfd與RNAP的結合，并說明細胞中通常處于“關閉狀態”—無活性構象的Mfd，遇到滯留在模板鏈上的RNAP便通過其D4結構域與RNAP的β亞基相互作用，引起D2-D7抑制型構象發生變化，并激活其轉位酶活性[57].借助ATP水解提供的能量，Mfd取代RNAP使其從DNA模板解離，從而暴露出模板鏈上的損傷部位[55]，同時Mfd也露出BHM結構域，并招募結合UvrA[11].細胞內單分子研究驗證UvrA遠端的ATP酶位點催化ATP水解，使UvrA二聚體與Mfd結合，并導致移位停止，同時招募UvrB，形成Mfd-2UvrA-UvrB復合物，隨后UvrA近端ATP酶催化ATP水解，使UvrB通過β發夾與DNA結合，并最終導致2UvrA與Mfd同時解離[11,56].后續招募的UvrD和UvrC分別發揮移除損傷單核苷酸鏈和切除DNA的作用，其形成的缺口由DNA聚合酶和DNA連接酶修復完全[55].值得一提的是，Mfd可以解離模板鏈上較強損傷處的RNAP，也能促進較弱損傷處RNAP的變位而跨越損傷[58].事實上，Mfd可與非NER因子共同作用，以一種易錯的方式修復DNA損傷[48,49].當DNA復制叉與轉錄中的RNAP發生碰撞時，Mfd可通過促進RNAP的變位，促使碰撞后的復制叉直接重啟[16]，但在低核苷酸濃度下，RNAP大多選擇滯留，此時Mfd會增強轉錄終止[58].

　　DksA，以Mfd類似方式，也會解離滯留在DNA損傷處的RNAP，進而修復DNA模板上的損傷[59].DksA由151氨基酸組成的轉錄因子,具有5條α螺旋，分成3個結構域[60].分別是球形結構域(Gdomain)、卷曲螺旋結構域(CCdomain)、C-末端結構域(C-terminaldomain)[61].DksA通過CC結構域進入RNAP的次級通道與RNAP相互作用，但并不與活躍的轉錄復合物結合[62].DksA單獨與RNAP的相互作用使得RNAP的DNA結合主通道βlobe/i4結構域發生變化，從而破壞RNAP的穩定性[59].不過，體外研究表明DksA并不影響RNAP穩定性[59].DksA單獨與RNAP的結合會降低RNAP-DNA穩定性，有助于移除RNAP而暴露損傷的DNA片段，但此過程并不破壞RNA:DNA雜合體，RNA還可為DNA合成作引物[59,63].

　　不同誘導劑引發的DNA雙鏈斷裂損傷中，DksA的應答存在差異[59,62].對腐草霉素(Phleomycin)誘導所產生DNA的DSB損傷，DksA以一種被動作用的方式參與RNAP-S修復[62].DksA和GreA同為RNAP次級通道的結合因子.與ppGpp協同[19]，DksA可通過與反回溯因子GreA競爭性結合RNAP次級通道而增強UvrD的回溯作用[62].對萘啶酸(nalidixicacid,Nal)誘導產生的帶有拓撲異構酶復合物的DSB損傷來說DksA是必須的[59].此時DksA不依賴于ppGpp，而是直接促進RNAP的移除但并不發生RNA的解離[59].——論文作者：王菲爾**，楊繹煊**，莫日根**

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