聚乙烯亞胺對脂質體與溶菌酶相互作用的影響

發布時間：2020-02-13所屬分類：農業論文瀏覽：1次

摘 要： 摘要:為了解聚乙烯亞胺(PEI)基因載體材料對生物體的細胞毒性機理，采用動態光散射、紫外可見光吸收光譜、熒光光譜和圓二色譜研究PEI(分子量為25kDa)對二油�；�磷脂酰絲氨酸(DOPS)脂質體與溶菌酶相互作用的影響。實驗發現:PEI對溶菌酶的構象影響不明顯，但是P

　　摘要:為了解聚乙烯亞胺(PEI)基因載體材料對生物體的細胞毒性機理，采用動態光散射、紫外—可見光吸收光譜、熒光光譜和圓二色譜研究PEI(分子量為25kDa)對二油�；�磷脂酰絲氨酸(DOPS)脂質體與溶菌酶相互作用的影響。實驗發現:PEI對溶菌酶的構象影響不明顯，但是PEI與DOPS的靜電結合能引起脂質體膜結構的變化并對脂質體與溶菌酶的相互作用產生影響。在水溶液中，溶菌酶與DOPS脂質體結合，部分嵌入脂質體雙分子層的疏水區，導致溶菌酶α-螺旋結構的減少，PEI與DOPS脂質體的結合增強了脂質體膜內疏水性及其與溶菌酶的相互作用。

　　關鍵詞:聚乙烯亞胺;磷脂酰絲氨酸;脂質體;相互作用

　　基因治療是當前生物醫學領域的前沿研究，為惡性腫瘤、神經系統疾病及遺傳疾病的治療提供了新方法，該技術的關鍵是需要建立高效低毒的基因載體。聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)作為典型的陽離子聚合物，由于其高電荷密度和強大的“質子海綿效應”而擁有良好的基因轉染效率，分子量為25kDa的支鏈PEI(bPEI25k)被認為是聚合物基因載體的“黃金標準”[1]。PEI具有不同程度的細胞毒性，但是目前人們對其細胞毒性機理的了解還相當有限[2-3]。研究發現，PEI的毒性與其對細胞膜的擾動有關[4-7]。細胞膜主要由脂類、蛋白質、糖類等組成，而蛋白質與物質傳遞、能量轉換及細胞識別等功能密切相關。生物體內廣泛存在生物膜與蛋白質的相互作用，蛋白質與生物膜中的磷脂以疏水和靜電相互作用，不僅改變自身的空間構象如去折疊或造成蛋白質聚集等，而且還改變磷脂膜的分布與排列進而影響生物膜的功能與結構[8-9]。

　　溶菌酶(Lysozyme，Lys)在體內廣泛存在，通過水解肽聚糖的糖苷鍵破壞各種致密的微生物膜結構，具有很強的抗菌消炎作用[10]。Lys的抗菌作用與Lys和細菌膜脂質相互作用有關，研究發現Lys能分別滲透到大腸桿菌的外膜和內膜，同時能使細胞質膜去極化而引起細胞質滲漏[11]。Tsunoda等[12]、Kinnunen等[13]和Gorbenko等[14]認為Lys以靜電作用吸附在負電磷脂膜如磷脂酰甘油(phatidylglycerol，PG)、磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)磷脂膜表面，并通過疏水作用部分插入磷脂膜雙分子層，從而使磷脂膜的結構和Lys的構象發生變化。

　　為研究PEI對蛋白質與脂質體相互作用可能造成的影響，筆者選用二油酰基磷脂酰絲氨酸(dioleoylphosphatidylserine，DOPS)制備脂質體來模擬細胞膜，采用動態光散射、紫外—可見光吸收光譜、熒光光譜和圓二色譜研究PEI25k對DOPS-Lys的相互作用及其對Lys構象的影響。

　　1實驗部分

　　1.1材料和試劑

　　DOPS購自于德國Lipoid;Lys、支化PEI25k均購自于美國Sigma;實驗中所有溶劑為色譜純，來自西隴化工;實驗中PBS緩沖液濃度為10mmol，pH7.4。所有的材料均未經過進一步的純化。PEI和Lys溶解于10mmol磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH7.4)，分別配制5mg/mL、400μmol的儲液，以HCl/NaOH溶液調節pH至7.4，0～5℃保存備用，使用時以PBS稀釋至所需要的濃度。

　　1.2實驗過程及儀器

　　1.2.1脂質體的制備

　　準確稱取一定量的DOPS溶于6mL氯仿—甲醇混合溶劑(體積比為2∶1)，45℃旋轉蒸發去除溶劑，氮氣沖刷磷脂膜30s，真空干燥過夜，加入5mLPBS進行水化，超聲波分散2h后用美國默格LiposoEasyLE-1型脂質體擠出器擠壓碳酸酯膜21次，所得大單層脂質體(LUV)用PBS稀釋至100mL，Stewart法[15]測定磷脂含量，0～5℃保存備用。

　　1.2.2動態光散色

　　準確移取PEI儲液、Lys儲液、DOPS脂質體儲液和PBS過濾液，配制PEI濃度系列變化的PEI-DOPS和PEI-Lys-DOPS分散液(Lys最終濃度為5μmol，DOPS終濃度為250μmol)，使用馬爾文ZetasizerNanoZS型粒徑電位儀測樣品的粒徑。

　　1.2.3紫外吸收光譜法

　　配制PEI濃度系列變化的PEI-Lys溶液和PEI-Lys-DOPS分散液，以相同濃度的PEI溶液作為參比，使用UV-2501PC分光光度計(日本島津Shimadzu)測定Lys的紫外吸收光譜，波長掃描范圍為200～600nm。

　　1.2.4熒光光譜法

　　配制PEI濃度系列變化的PEI-Lys溶液和PEI-Lys-DOPS分散液，用RF-6000熒光分光光度計(日本島津Shimadzu)測定Lys發射熒光光譜(λex=295nm)和同步熒光光譜(Δλ=15nm)，波長掃描范圍為250～450nm，激發和發射狹縫均為5.0nm。實驗時以相同濃度的PEI溶液和PEI-DOPS溶液作為背景，并從最終結果中扣除。

　　1.2.5圓二色譜

　　配制PEI濃度系列變化的PEI-Lys溶液和PEI-Lys-DOPS分散液，使用光程為2mm的石英比色皿，在ChirascanSpectrometer型CD光譜儀(英國AppliedPhotophysicsLtd公司)室溫下測定Lys圓二色譜，波長掃描范圍為190～260nm，采樣間隔為0.5nm，響應時間為0.5s。同樣實驗條件下測定相同濃度的PEI溶液及PEI-DOPS溶液的圓二色譜，其影響在最終結果中扣除。

　　2結果與討論

　　2.1PEI對Lys-DOPS脂質體穩定性的影響

　　粒徑是反映脂質體結構穩定性的重要參數，為了解PEI對Lys-DOPS脂質體穩定性的可能影響，分析了DOPS脂質體在含Lys和PEI溶液中流體動力學直徑的變化，結果見圖1。制備的DOPS脂質體在PBS中的流體動力學直徑約為78.3nm，添加少量PEI導致脂質體流體動力學直徑急劇增大，在cPEI25k=0.01mg/mL附近達到最大值后迅速減小，cPEI25k>0.1mg/mL時，脂質體流體動力學直徑基本不變并與無PEI溶液中結果相仿。這一結果與Yasuhara等[16]的研究相吻合，Yasuhara認為PEI在DOPS脂質體表面的靜電結合引起脂質體表面電位的變化，少量PEI引起脂質體產生膜融合，高濃度的PEI導致脂質體表面電位發生反轉而阻礙膜融合的產生。

　　圖1同時顯示，PEI-Lys-DOPS脂質體分散液脂質體粒徑也有相似的變化規律，不同的是Lys的存在使得脂質體粒徑變化更為顯著，表明Lys與脂質體結合并導致脂質體膜結構發生變化。研究顯示，Lys通過靜電作用結合在DPPG脂質體表面，蛋白質部分插入磷脂雙分子層。Gorbenko等[13-14]的研究顯示Lys與PG、PS磷脂膜的靜電相互作用導致Lys及磷脂膜結構的變化，Lys部分嵌入磷脂雙分子膜疏水碳氫區域。

　　2.2吸收光譜

　　紫外—可見光吸收是分析蛋白質構象變化的常用方法，為了了解PEI25k對DOPS脂質體-Lys相互作用的可能影響，測定了PEI濃度系列變化的DOPS脂質體-Lys-PEI25k溶液的吸收光譜，考慮到PEI25k對Lys構象的影響，同時測定了Lys-PEI25k溶液的吸收光譜，結果見圖2。在PBS中，Lys分別在216nm和281nm出現一個強的吸收峰，分別有蛋白質骨架肽鍵n→σ*躍遷和芳香族氨基酸殘基的π→π*躍遷產生[17]。由圖2可見，Lys-PEI溶液中Lys在216nm處的吸收峰隨PEI的濃度增加而增強，并伴有輕微的紅移，表明PEI與Lys作用形成了復合物并可能導致Lys二級結構的變化[17]。PEI25k與DOPS的相互作用使Lys骨架肽鍵吸收強度下降，最大吸收波長紅移，然而隨著PEI濃度的增大，Lys在216nm處吸光度急劇增大，最大吸收波長明顯紅移，說明DOPS增強了PEI與Lys的相互作用。

　　2.3熒光光譜分析

　　熒光光譜被廣泛應用來研究蛋白質三級結構變化。蛋白質的主要熒光由色氨酸殘基和酪氨酸殘基貢獻，兩者的熒光光譜發生相互疊加，采用295nm激發波長避免酪氨酸殘基與色氨酸殘基之間的共振能量轉移，由于蛋白質分子構象變化對后者發射熒光的影響，同時利用同步熒光光譜法(Δλ=15nm)獲得酪氨酸殘基的熒光特征，結果分別見圖3和圖4。

　　色氨酸對所處微區環境的變化很敏感，峰位發生紅移說明其所處微區環境疏水性減弱或極性增強[18]。Lys具有多個色氨酸殘基，分布在蛋白質表面和疏水內核[19]，因此由圖3可見，Lys色氨酸殘基最大熒光發射波長出現在338nm附近[19]。隨著溶液中PEI濃度的增加，Lys色氨酸熒光發射波長沒有發生明顯變化，說明其所處微區極性沒有發生變化，但是可能由于與PEI結合減少了水分子碰撞引起的動態猝滅，其熒光強度略有增加。DOPS脂質體的存在使得Lys色氨酸熒光強度增加，最大發射波長蘭移，說明色氨酸殘基所處微區環境極性下降，Lys分子可能嵌入DOPS脂質體雙分子層，這一結果與Tsunoda[12]和Kinnunen[13]的研究相一致。PEI-Lys-DOPS脂質體分散液中Lys色氨酸熒光強度進一步增加，最大發射波長蘭移更加明顯，說明PEI與DOPS的結合造成脂質體膜內環境的疏水性增加。

　　與色氨酸殘基相比，酪氨酸殘基的熒光對溶劑極性的變化不敏感。由圖4可以看到，隨著溶液中PEI濃度的增加，Lys酪氨酸殘基最大熒光發射波長基本保持不變，但是其熒光強度略有增加。DOPS的存在使Lys酪氨酸殘基的熒光變化更為明顯，這一規律與色氨酸殘基熒光相類似，說明酪氨酸殘基熒光的變化不是由于蛋白質構象變化引起的酪氨酸殘基與色氨酸殘基之間共振能量轉移的變化造成的，而應該歸因于與PEI和DOPS脂質體相互作用減少了溶劑分子的碰撞猝滅。

　　2.4圓二色譜

　　圓二色光譜是分析蛋白質二級結構的常用工具，在遠紫外區(190～260nm)的圓二色光譜與蛋白質的α-螺旋和β-折疊含量有關[20]。本文測定了Lys-PEI溶液體系和Lys-PEI-DOPS溶液體系中的遠紫外CD光譜，結果見圖5。Lys在208nm和222nm處出現兩個顯著的負峰，這是α-螺旋結構的特征峰[21]。實驗發現，PEI對Lys二級結構的影響很小，但是DOPS脂質體使得Lys在208nm和222nm圓二色橢圓度負值略有減小，溶液中添加PEI使得這一規律更加明顯，說明PEI增強了DOPS與Lys的相互作用，并導致Lys的α-螺旋結構結構減少。

　　3結論

　　PEI分子具有大量的氨基基團，易于與Lys和DOPS脂質體結合形成復合物。PEI與Lys的結合對Lys的構象影響不明顯，但是PEI與DOPS的靜電結合能引起脂質體膜結構的變化并對脂質體與Lys的相互作用產生影響。在水溶液中，Lys與DOPS脂質體結合，部分嵌入脂質體雙分子層的疏水區，導致溶菌酶α-螺旋結構的減少，PEI與DOPS脂質體的結合增強了脂質體膜內疏水性及其與Lys的相互作用。

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