發布時間：2021-10-15所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：提出一種結合顯微鏡和微流控芯片技術的紅細胞多角度形態學分析方法，實現了紅細胞的動態顯微成像，用于紅細胞多角度形態學的測量與分析。利用微流控芯片的縮/擴結構使紅細胞在特定位置產生旋轉或翻轉;利用MATLAB對采集到的視頻圖像進行分幀處理，通過
摘要：提出一種結合顯微鏡和微流控芯片技術的紅細胞多角度形態學分析方法，實現了紅細胞的動態顯微成像，用于紅細胞多角度形態學的測量與分析。利用微流控芯片的縮/擴結構使紅細胞在特定位置產生旋轉或翻轉;利用MATLAB對采集到的視頻圖像進行分幀處理，通過灰度調整、中值濾波、形態學處理、質心法、目標物識別、動態跟蹤等算法處理后，實現對血細胞的有效識別與準確的分類、計數;對分類結果進行多角度形態學分析，并對不同形態紅細胞進行最大直徑的測量。通過對單細胞多幀關聯圖像的分析，驗證方法的準確性;并利用紅細胞多角度形態學分析方法，對糖尿病患者血液及正常人血液進行實驗。結果表明，糖尿病患者紅細胞相比于正常人紅細胞，其平均最大直徑及分布寬度均增大。微流控芯片結合圖像處理的方法可以實現糖尿病患者與正常人紅細胞高通量檢測及多角度分析，為其他類型樣本細胞多角度形態學測量提供新方法。
關鍵詞：微流控芯片;動態顯微成像;多角度形態學分析;紅細胞分布寬度
0引言
紅細胞(RedBloodCells，RBCs)也稱紅血球，是血液中數量最多的一種血細胞，具有攜帶氧氣，輸送二氧化碳，維持血流結構等諸多功能，并參與機體免疫調控的自我調節，在人體血液循環系統中發揮著重要作用[1-4]。通常情況下，成熟的紅細胞呈雙凹圓盤狀[2]，其表面積和體積之比較大，有利于進行氣體交換和自身變形。如果紅細胞形態異常，其形態及體積將發生改變，常見的異常紅細胞形態有水滴形、球形、橢圓形、鐮刀形、半月形等[5]。因此，紅細胞形態的變化，某種意義上決定著人體的健康狀況，是診斷很多疾病的重要指標之一。
傳統的檢測血液細胞的儀器大多基于Coulter原理，對細胞形態進行間接檢測[6，7]。這種方法存在一定的缺陷，當檢測交叉細胞時，其信號會產生疊加現象，通常對糖尿病患者紅細胞粘連及血小板聚集現象產生誤差。為了克服這一缺點，需要對細胞進行直接的形態學測量，醫院里常用的方法是人工血涂片鏡檢法，此方法是血液細胞學檢查的基本方法，可以通過顯微鏡對血細胞形態進行靜態分析，對各種血液病的診斷有很大的價值[8，9]。但血片制備和染色不良，常使細胞鑒別發生困難，甚至導致錯誤結論，另外，此方法只能對異常細胞進行單一角度的檢測，無法實現對大樣本量、多角度的檢測[10]，不僅費時，而且效率和精度都很低。為了實現對大樣本量的檢測，微流控芯片在生物醫學研究中顯示出巨大潛力，以微流控技術為基礎的圖像細胞分析法開始流行起來。該方法成本低，不需要復雜的樣品制備，而且能夠提供細胞形態的可視化信息，實現了對大樣本量的檢測。
因此，本文通過顯微鏡結合微流控芯片的方法，提出了動態顯微成像技術對紅細胞多角度形態分析的方法。這種方法不僅可以實現對紅細胞大樣本量、高分辨率的檢測，同時利用細胞跟蹤技術，對紅細胞進行準確識別，實現對紅細胞多角度的形態學分析。
1動態顯微成像原理
為了獲取紅細胞在特定位置不同角度的形態，需要設計特定的通道結構，并利用顯微鏡對紅細胞在通道中的流動狀態進行采集，通過動態圖像處理方法對采集到的視頻圖像進行處理，進而實現對紅細胞多角度形態學的分析。
1.1單細胞多角度形態學獲取
紅細胞在通道中流動時，發生的旋轉或翻轉是隨機的、不確定的，另外，微流控芯片通道結構設計的不同，它的作用和效果也不盡相同[11-13]。為了使紅細胞在特定位置旋轉或翻轉，得到其不同角度的形態，本文將微流控芯片通道結構設計成進樣口多彎曲結構與成像區域凹凸結構相結合的整體通道結構。
由于細胞的聚集性與黏附性，細胞在流體中流動時，會產生聚集成一團的現象，使成像區域不能更好的觀察細胞的形態學特征，造成細胞的誤識別。為了減少細胞聚集，將成團細胞順序排列，在成像區域能夠呈現出一排排的單細胞，在進樣口增加了多彎曲結構。另外，由于紅細胞特殊的雙凹圓盤結構，在流體中流動時，紅細胞會出現隨機的、多角度的傾斜、翻轉、旋轉等現象。為了解決紅細胞隨機旋轉/翻轉現象，本文將成像區域通道結構設計成縮/擴結構，有效改變了流道內速度分布情況，實現了細胞在特定位置的翻轉/旋轉，增加了紅細胞的不同形態特征，從而實現對紅細胞更準確的識別與分析。
利用上述的通道結構，使紅細胞在特定位置發生旋轉或翻轉，利用所呈現出來的不同角度的形態，對其形態參數進行測量。為了得到紅細胞更為準確的最大直徑，對單細胞的每一幀形態進行測量，計算其在此形態時的直徑D，并將此單細胞所有形態下測得的直徑(D1、D2、D3、…)進行比較，得到其最大直徑。細胞多角度形態學最大直徑獲取示意圖如圖1所示。
1.2單細胞多幀圖像關聯分析
基于圖像法的微流控芯片紅細胞形態學分析通常涉及圖像預處理、目標檢測、目標跟蹤三個主要部分[14-16]。整體流程圖如圖2所示。(1)圖像預處理：將視頻圖像拆分為單幀灰度圖像，采取分量法對原始圖像進行灰度化，選擇圖像清晰且背景噪音小的范圍作為研究對象。為了消除圖像噪聲，改善圖像質量，本文采用3×3中值濾波對區域圖像進行處理，最后，設置合適的閾值對灰度圖像進行二值化處理[17-19]。(2)目標檢測：在二值化圖像中，對目標物進行檢測與識別，利用質心法標記出所需要分析的目標物。首先，利用imclearborder函數將通道背景和在實驗視野范圍邊緣的不完整的細胞進行清除，減小圖像識別過程中的干擾;再利用連通域與面積判斷的方法，將大于一定面積的細胞(紅、白細胞)識別出來，剔除掉血小板，從而實現對目標物的檢測與識別[17-18]。另外，需要對目標物體的橫、縱坐標進行計算，標記其當前幀的質心位置。在此過程中，只對大于一定面積的目標物進行質心標記，并建立當前幀橫、縱坐標數據集X1、Y1。(3)目標跟蹤：在下一幀目標物的識別中，利用相同的檢測方法，對當前幀目標物進行檢測，并建立當前幀質心點坐標集X2、Y2。根據細胞位移特點，分別為當前幀每一個目標物進行前幀匹配，建立幀與幀之間的數據關聯，并繪制其運動軌跡跟蹤曲線，最后將當前幀目標質心點坐標集X2、Y2作為下一幀匹配的坐標集X1、Y1。(4)細胞分類、計數：對單細胞多幀跟蹤結果進行分析，利用紅、白細胞特征進行判斷，進而實現對紅、白細胞的分類、計數。最后，對分類結果的紅細胞多幀關聯的灰度圖像進行形態學分析。
2實驗與結果分析
2.1實驗系統搭建
實驗系統主要包括氣路系統、微流控芯片、顯微成像三個部分。氣路系統主要由壓力泵和調節閥組成，用來控制樣品的進液速度，使全血細胞順利的通過微流道，并可以在顯微鏡中清晰成像。用壓力調節器調制進液樣品的流速，其壓力值大小可由壓力表測量。微流控芯片結構方面，利用進樣口多彎曲結構與成像區域凹凸結構相結合的整體通道結構設計芯片結構，并將縮/擴的凹凸結構作為成像區域，對血細胞成像效果進行驗證。圖3(a)為實驗系統圖，圖3(b)為微流控芯片實物圖，圖3(c)為所涉及的微流道結構示意圖，圖3(d)為圖3(c)虛線矩形框通道結構尺寸放大圖及流體流動方向。
2.2單細胞多角度形態分析結果
為了驗證本文基于動態顯微成像對紅細胞多角度形態學分析的準確性，利用人血細胞對紅、白細胞進行形態學分析，并進行準確的分類與計數。取5μL的健康人血細胞加入1mL的PBS溶液中，充分混勻，將其作為實驗的樣本溶液。取少量溶液加入微流控芯片儲液池中，通過調節壓力泵調節閥控制樣本溶液的流速，利用顯微鏡觀察微流控芯片的成像區域，記錄細胞通過通道的全過程。
基于以上圖像處理方法對實驗視頻進行分析，對識別、跟蹤到的細胞(紅、白細胞)，在視野范圍內運動結束時，對其運動軌跡所有形態進行分析，利用紅細胞的雙圓環結構進行判斷與區分。對88000幀圖像進行處理，根據結果可知，當紅細胞平行于通道時，圖像處理可得到雙圓環結構(紅細胞特定結構)，將單細胞跟蹤到的所有形態進行分析，如有一幀為雙圓環結構，可把它定義為紅細胞，進而實現紅、白細胞的區分。紅細胞圖像處理目標跟蹤運動軌跡圖如圖4所示。同上述紅細胞圖像處理相同，圖5為白細胞運動跟蹤軌跡圖。
根據1.2節所描述的處理步驟，對實驗記錄的視頻進行處理。通過質心定位法建立數據坐標集，利用位移判斷細胞上幀位置，建立幀與幀之間的相關聯并繪制其運動軌跡跟蹤曲線。計數結果顯示，檢測出紅細胞數量為11270個，白細胞數量為11個。紅、白細胞比例約為1000∶1，此方法可實現對紅、白細胞的準確識別與計數。
2.3紅細胞直徑測量與統計分析
為了驗證微流控結合顯微鏡對細胞多角度形態學分析的可行性，實驗分別對糖尿病患者和正常人進行血液采集，并對兩組血液進行相同濃度(200：1)配置，分析糖尿病患者紅細胞與正常人紅細胞形態大小的差異[20]。在進行直徑標定前對細胞做旋轉處理，即將細胞“擺正”，此時細胞質心的橫、縱坐標處將會產生最大直徑，如圖6(a)所示。利用跟蹤、識別對檢測出的紅細胞進行測量，分析每一個紅細胞在視野范圍內的不同形態，對其所有形態的最大直徑進行檢測，利用其質心坐標點的灰度二維曲線反值圖的峰值寬度進行標定，對比得到其最大直徑。
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對跟蹤、識別出的紅細胞進行測量，利用其質心位置的坐標點，繪制其灰度二維曲線圖，如圖6所示。對每一段視頻隨機選取十幀圖像，經過對通道中實際尺寸已知的“十”字結構與其灰度二維曲線反值圖的峰值寬度對比，得到紅細胞直徑灰度二維曲線反值圖的峰值寬度與實際尺寸有固定比例。得到其灰度二維曲線反值圖的峰值寬度與實際尺寸有固定比例，因此，在后續對紅細胞不同形態的測量中，統一對其灰度曲線反值圖的峰值寬度進行測量，并據此計算紅細胞相對直徑。
圖像處理所計算出來的最大直徑為像素點，為了避免視頻拍攝過程中放大尺寸所造成的誤差，利用通道中的固定尺寸參數進行比例換算，得到與實際情況相匹配的數值。正常紅細胞與糖尿病患者紅細胞最大直徑分布如圖7所示。
此實驗統計中，正常人紅細胞統計個數為10003個，平均最大直徑約為7.886μm，標準差為0.761;糖尿病患者紅細胞統計個數為10001個，平均最大直徑約為10.026μm，標準差為1.837。統計結果在數值上均有增大，另外，統計圖可以直觀地看出，糖尿病患者具有更大的最大直徑分布寬度，正常人紅細胞最大直徑分布寬度大約為5～9.5μm，糖尿病患者最大直徑分布寬度大約為5.5～14μm。
3結論
顯微鏡結合微流控芯片技術，通過圖像處理的方法，實現了對紅、白細胞準確的分類、計數，通過對紅細胞多角度形態學的分析，可準確測量紅細胞的最大直徑。為了驗證該方法的可行性，分別對糖尿病患者和正常人紅細胞進行實驗和分析。正常人紅細胞最大直徑分布寬度大約為5～9.5μm，糖尿病患者約為5.5～14μm，糖尿病患者紅細胞相比于正常紅細胞最大直徑會增大。實驗結果測得，正常人紅細胞平均最大直徑約為7.886μm，糖尿病患者約為10.026μm，此方法可獲得紅細胞的最大直徑;另外，糖尿病患者紅細胞最大直徑分布寬度比正常紅細胞最大直徑分布寬度更大。此方法實現了對血細胞大樣本量、高分辨率的檢測，可對紅細胞多角度的不同形態進行準確識別，從而得到更準確的紅細胞最大直徑，為紅細胞形態學分析提供方法。——論文作者：張朦，孟曉辰*，祝連慶
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