發布時間：2021-09-28所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：建立了測定硝苯地平中基因毒性雜質2、6和12的超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質譜法(UHPLC-OrbitrapHRMS)。樣品以甲醇為溶劑，提取后直接進樣分析。采用ACEEXCELTM3C18-AR色譜柱(150mm4.6mm，3m)分離，流動相為甲醇-0.1%甲酸水(65∶35，v/v)，等度
摘要：建立了測定硝苯地平中基因毒性雜質2、6和12的超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質譜法(UHPLC-OrbitrapHRMS)。樣品以甲醇為溶劑，提取后直接進樣分析。采用ACEEXCELTM3C18-AR色譜柱(150mm×4.6mm，3μm)分離，流動相為甲醇-0.1%甲酸水(65∶35，v/v)，等度洗脫。質譜部分采用電噴霧電離(ESI)源。采用正離子平行反應監測(PRM)掃描模式，質譜分辨率為35000FWHM，雜質2、6、12的[M+H]+母離子準確質量數分別為m/z347.1230、361.1026、347.1230，提取[M+H]+碎片離子準確質量數分別為m/z315.0968、298.1069、315.0968，歸一化碰撞能量(NCE)分別為10%、42%、10%，外標法定量。對方法進行了詳細的方法學驗證，結果表明，該法專屬性良好，溶劑對雜質測定無干擾;雜質2、6、12質量濃度與其峰面積在0.2～100ng/mL范圍內呈現良好的線性關系，相關系數(r)均≥0.9998;雜質2、6、12在低、中、高3個水平下的回收率為96.9%～105.0%，RSD為1.21%～5.12%，檢出限均為0.05ng/mL，定量限均為0.2ng/mL。應用該方法對3批硝苯地平樣品中的雜質2、6、12進行測定，3批樣品均未檢出雜質6，但均檢出雜質2和雜質12，其檢出量未超過限度。該方法靈敏、快速、準確，操作簡便，可為藥企對硝苯地平的質量控制提供參考，并為藥監部門的監管提供有力的技術支持。
關鍵詞：超高效液相色譜;高分辨質譜;基因毒性;硝苯地平;雜質
二氫吡啶類鈣拮抗劑是一類降壓作用強、臨床應用廣、上市品種多的心血管疾病治療藥[1，2]，主要包括硝苯地平、氨氯地平、樂卡地平、尼莫地平、尼卡地平、尼群地平、非洛地平、拉西地平等在臨床中常用的藥物。硝苯地平是一種常見的第一代二氫吡啶類鈣拮抗劑，可選擇性地抑制鈣離子進入心肌細胞和平滑肌細胞的跨膜轉運，抑制鈣離子從細胞內釋放，且不改變血漿中鈣離子濃度，對心血管平滑肌鈣通道有阻滯作用，干擾肌肉的興奮收縮，有較強的擴張血管作用，臨床上主要用于高血壓、心絞痛、心律失常及其他心血管疾病的治療[3，4]。當前，對于硝苯地平雜質的研究主要集中在非致突變性雜質[5-10]，而對其基因毒性雜質的調查鮮有報道。硝苯地平雜質2、6、12的化學結構如圖1所示，雜質2和雜質12含有的硝基基團、雜質6含有的氮雜芳基N-氧基團均屬于基因毒性警示結構，應按照致突變性雜質的要求制定雜質限值[11]。
目前已報道的硝苯地平雜質的測定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[5，7，8]、超高效液相色譜法(UHPLC)[10]和液相色譜-質譜法(LC-MS)[6]。近年來，靜電場軌道阱(Orbitrap)高分辨質譜技術憑借其超高質量精度、高靈敏度和高選擇性的優勢，在藥品雜質分析方面的應用逐漸增多[12-15]。本研究建立了UHPLC-OrbitrapHRMS測定硝苯地平原料藥中基因毒性雜質2、6和12的方法，并進行了詳細的方法學驗證。
1實驗部分
1.1儀器、試劑與材料
ThermoQExactivePlusTM超高效液相色譜-高分辨質譜聯用系統包括Ultimate3000三元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器以及Orbitrap高分辨質譜部分，Tune2.9軟件用于質譜儀的調諧和質量軸的校正，XCaliburTM4.0軟件用于設置儀器方法、編輯序列和處理數據，以上均購于Thermo公司(德國);MettlerXS205型電子天平(MettlerToledo公司，瑞士)用于精密稱量。硝苯地平原料藥由山東省某醫藥公司提供;雜質2對照品購自STD公司(美國)，批號為196132N-SL-01，純度為98.7%;雜質6對照品購自QCC公司(美國)，批號為29-APR-19-32，純度為99.98%;雜質12對照品購自STD公司(美國)，批號為1656312B-SL-01，純度為99.6%;質譜級甲醇(純度99.9%)、甲酸(純度>99%)均購自Fisher公司(美國);實驗用18.2MΩ·cm純水由Milli-QAdvantageA10超純水系統(Millipore公司，美國)制得。
1.2實驗條件
1.2.1對照品溶液的制備
分別精密稱取雜質2、6和12對照品10.07、10.20和10.26mg，分別以甲醇作為稀釋劑，制成質量濃度分別為397.56、407.92和408.76μg/mL的對照品儲備液。精密移取上述對照品儲備液適量，加甲醇稀釋得質量濃度約為20μg/mL的單一對照品溶液。精密移取20μg/mL各單一對照品溶液適量，加甲醇逐步稀釋，得到質量濃度約為0.05、0.2、0.5、2、5、10、20、50、100ng/mL的雜質2、6、12混合對照品標準溶液。
1.2.2樣品前處理
取硝苯地平約25mg，精密稱定，置于50mL離心管中，精密加入甲醇25mL，渦旋使其完全溶解，搖勻即得。
1.2.3色譜條件
色譜柱為ACEEXCELTM3C18-AR柱(150mm×4.6mm，3μm)，柱溫為35℃，自動進樣器溫度為8℃，流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液(65∶35，v/v)，等度洗脫，流速為0.6mL/min，分析時間為18min，進樣量為5μL，檢測波長為235nm。
六通閥切換設置：保留時間為7.5～11.6min時，流動相進入廢液，其余保留時間，流動相進入質譜檢測。
1.2.4質譜條件
電噴霧電離源，正離子模式，噴霧電壓3.5kV;毛細管溫度350℃，輔助氣加熱器溫度400℃;鞘氣流量60arb，輔助氣流量20arb。采用平行反應監測(PRM)質譜掃描模式，分辨率設為35000FWHM，隔離窗口(isolationwindow)設為m/z1.5，微掃描(microscans)設為3，自動增益控制(AGCtarget)設為2×105，最大離子注入時間(maximumIT)設為100ms。雜質2、6、12的具體質譜參數見表1。
2結果和討論
2.1實驗條件考察
2.1.1質譜條件優化
目前尚無硝苯地平雜質2、6、12的毒理學數據，可采用ICHM7R1推薦的毒理學關注閾值(TTC)來計算可接受攝入量，即單個雜質的可接受攝入量為1.5μg/d[16]。硝苯地平每日最大用量為80mg，故硝苯地平中雜質2、6、12限值的計算公式[11]為雜質限值=雜質可接受攝入量÷藥物每日最大用量=18.75ng/mg。此限值比硝苯地平有關物質的限度(0.1%或0.2%)[11]低2個數量級，對儀器靈敏度要求較高，宜采用LC-MS進行測定。
本研究所使用的ThermoQExactivePlusTM超高效液相色譜-高分辨質譜聯用系統的質譜部分串聯了四極桿和Orbitrap兩個質量分析器，擁有多樣化的質譜掃描模式。在開發質譜方法時，考察了目標物選擇性離子監測(TargetdSIM)、全掃描-數據依賴的二級掃描(FullMS/ddMS2)、PRM等不同的質譜掃描模式，結果發現在雜質2、6、12質量濃度≥10ng/mL時，3種掃描模式靈敏度相當，而當雜質2、6、12質量濃度低于10ng/mL時，在TargetdSIM或FullMS/ddMS2模式下采集的總離子流色譜圖中無法提取雜質的色譜峰，但PRM模式下雜質2、6、12質量濃度為0.05～10ng/mL時依然能夠獲得較好的提取離子色譜圖。因此，本研究采用PRM質譜掃描模式。采用Tune2.9軟件優化雜質2、6、12的碰撞能量，選擇合適的提取碎片離子，并對離子源氣流速、溫度、電壓進行了精細調節和逐級優化，實現了雜質2、6、12的痕量檢測，最佳質譜條件如1.2.4節所示，3種雜質的高分辨二級質譜圖及碎片離子預測結構式如圖2所示。
2.1.2色譜條件的優化在本研究中，雜質2和雜質12與硝苯地平為同分異構體，3者分子式、準確質量數、提取離子質量數均完全相同，因此雜質2、12及硝苯地平色譜峰必須達到基線分離才能夠進行準確測定。另一方面，由于供試品溶液中含有高質量濃度的藥品主成分硝苯地平(約1.0mg/mL)，如果高濃度硝苯地平進入質譜系統，會污染離子源并產生嚴重的基質效應，影響痕量雜質2、6、12的準確測定。因此，應充分優化色譜條件，盡可能提高雜質2、6、12與硝苯地平的色譜分離度，再通過在線六通閥將硝苯地平色譜峰切換到廢液，避免高濃度硝苯地平進入質譜系統。實驗考察了島津Shim-packGISTTM苯基-己基柱(150mm×4.6mm，3μm)和ACEEXCELTM3C18-AR柱(150mm×4.6mm，3μm)等兩種不同類型色譜柱的分離效果。當采用島津Shim-packGISTTM苯基-己基柱時，雜質2與硝苯地平色譜峰保留時間相隔太近(<1min)，閥切換很難將硝苯地平主成分徹底切換，對其準確測定造成影響。采用ACEEXCELTM3C18-AR色譜柱(150mm×4.6mm，3μm)時，雜質6、硝苯地平、雜質2、雜質12的保留時間分別為6.25、10.74、14.26和15.91min。硝苯地平與3種雜質均實現了良好的色譜分離，通過六通閥控制將保留時間為7.5～11.6min時的流動相切入廢液，有效避免了高濃度硝苯地平的基質干擾，保護了質譜離子源，降低了雜質2和雜質12的基線噪音，使雜質測定更加準確可靠。
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2.1.3樣品前處理方法優化
中國藥典載明：硝苯地平在丙酮或三氯甲烷中易溶，在乙醇中略溶，在水中幾乎不溶[11]。然而，丙酮和三氯甲烷溶解性太強，會對液相色譜柱和液相色譜管路造成嚴重影響，同時也會使色譜圖上出現一些干擾峰。此外，考慮到甲醇與流動相的兼容性明顯優于乙醇。藥典載明，硝苯地平以甲醇作為溶劑可配制成質量濃度為1mg/mL的溶液[11]。因此，綜合以上考慮，本研究選用甲醇作為提取溶劑，硝苯地平樣品含量定為1mg/mL。結果表明，硝苯地平與雜質2、6、12均能完全溶于甲醇，形成澄清透明的溶液，前處理簡單。
2.2方法學考察
2.2.1專屬性
將甲醇溶劑和雜質2、6、12混合對照品溶液分別進樣測定，記錄色譜圖。甲醇溶劑的圖譜如圖3a所示，通過與對照品溶液提取離子色譜圖(見圖3b)對比可知，雜質2、6、12相同保留時間處無干擾峰存在，表明本方法專屬性良好。
2.2.2線性范圍
分別取0.2、0.5、2、5、10、20、50、100ng/mL的雜質2、6、12混合對照品溶液進樣測定，以峰面積作為y、分析物質量濃度(ng/mL)作為x，不加權重擬合線性校正曲線，建立回歸方程，計算相關系數(r)，如表2所示。結果表明，雜質2、6、12峰面積與其質量濃度分別在0.2～100ng/mL范圍內呈現良好的線性關系，r均≥0.9998。
2.2.3檢出限和定量限
精密量取質量濃度為0.2ng/mL的雜質2、6、12混合對照品溶液，用甲醇逐級稀釋，按照信噪比(S/N)≥3和≥10分別計算檢出限和定量限。結果表明，3種雜質的檢出限均為0.05ng/mL(即0.05ng/mg)，定量限均為0.20ng/mL(即0.20ng/mg)。3次定量限平行試驗中雜質2、6、12的平均信噪比分別為23、21和17，峰面積RSD分別為5.4%、4.9%和6.0%。定量限提取離子色譜圖如圖4所示。
2.2.4回收率和精密度
取硝苯地平約25mg(批號1911231)，精密稱取9份(低、中、高水平各3份)，先分別精密加入適量的雜質2、6、12混合對照品溶液，后續操作按照1.2.2節描述處理，得到加標回收試驗用供試品溶液，進樣測定。結果如表3所示，雜質2、6、12的加標回收率為96.9%～105.0%，RSD為1.21%～5.12%，符合藥典規定，表明雜質2、6和12回收率和精密度良好。
2.2.5穩定性
將質量濃度約為0.20ng/mL的雜質2、6、12混合對照品溶液保存于進樣瓶中，在自動進樣器中按照實驗條件放置0、8、12、24h后進樣測定，雜質2、6、12峰面積的RSD值分別為4.3%、5.1%和4.5%，說明該條件下雜質2、6、12在24h內穩定性良好。
2.2.6耐用性
微調分析條件，將柱溫分別調整為32℃和38℃、流速分別調整為0.55mL/min和0.65mL/min時，雜質的色譜峰形無變化，色譜保留時間和峰面積發生微小改變，各雜質峰面積和保留時間RSD值均<10%。因此，測定條件輕微變動不影響雜質2、6、12的檢測，方法耐用性良好。
2.3實際樣品檢測
采用已驗證的方法，對3批硝苯地平原料處理后，進樣測定，外標法計算樣品中雜質2、6、12含量，結果見表4，代表性提取離子色譜圖如圖5所示。3批樣品均未檢出雜質6，但均檢出雜質2和雜質12，檢出含量分別為0.315～0.382ng/mg和0.285～0.404ng/mg，遠低于限度規定(18.75ng/mg)。因此，樣品中雜質2、6、12的檢出量符合規定。
3結論
本研究建立了硝苯地平中痕量基因毒性雜質2、6、12的UHPLC-OrbitrapHRMS檢測方法，并進行了詳盡的方法學驗證。本方法靈敏度高，專屬性好，回收率高，線性范圍寬，填補了該領域的研究空白，可為藥企對硝苯地平的質量控制提供參考，并為藥監部門的監管提供有力的技術支持。——論文作者：郭常川1，譚會潔1，劉琦1，鞏騰飛2，王雪1，王程霖1，3，徐玉文1*
SCISSCIAHCI
