發布時間：2021-09-28所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要[目的]建立一種基于超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)快速測定野生毒蕈中6種鵝膏毒肽和鬼筆毒肽類毒素的分析方法。[方法]將采集的四川野生毒蕈子實體低溫烘干，用甲醇超聲提取，40℃旋轉蒸發近干，加水復溶，OasisHLB固相萃取小柱凈化，經WatersHSS
摘要[目的]建立一種基于超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)快速測定野生毒蕈中6種鵝膏毒肽和鬼筆毒肽類毒素的分析方法。[方法]將采集的四川野生毒蕈子實體低溫烘干，用甲醇超聲提取，40℃旋轉蒸發近干，加水復溶，OasisHLB固相萃取小柱凈化，經WatersHSST3色譜柱分離，ESI正離子模式下多反應監測(MRM)方式分析。[結果]6種毒肽在50～1000μg/kg具有良好的線性關系，相關系數均大于0.99，方法檢出限為30μg/kg。α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽、羧基三羥鬼筆毒肽在低、中、高3個濃度的平均回收率在93.1%～117.5%，變異系數(CV)在1.49%～7.77%。[結論]該方法能準確、靈敏地測定野生毒蕈中6種毒肽，適用于野生菌中毒肽毒素的測定。
關鍵詞野生毒蕈;鵝膏毒肽;鬼筆毒肽;超高效液相色譜-串聯質譜法
毒蕈即日常所說的毒蘑菇，是指不同類型的含有毒素的大型野生真菌，由于有些毒蕈在外觀上與食用菌沒有明顯區別，導致誤食毒蕈而引發中毒的事件時有發生，且在群體性食物中毒中，毒蕈中毒的致死率極高，其中肝損傷型毒蕈中毒致死率高達90%～100%[1]。據統計，我國毒蕈中毒事件中，95%是由鵝膏菌屬引起的[2]。因為鵝膏菌中含有化學性質穩定且毒性極強的鵝膏多肽類毒素，該類毒肽耐高溫、干燥和酸堿環境，一般的烹調加工不會破壞其毒性，不幸誤食后，毒肽就會通過消化系統進入肝臟，對肝臟造成嚴重的損傷，最終引發多器官功能衰竭而死亡[3-5]。現階段，國內外一般采用高效液相色譜法、高效液相色譜-飛行時間質譜法和高效液相色譜-串聯質譜法檢測毒肽毒素[6-11]，我國還沒有檢測毒肽毒素的國家標準。因此，該研究建立了一種利用超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定野生毒蕈中6種毒肽毒素的檢測方法，以期為野生菌毒素檢測提供一種高效的檢測方法。
1材料與方法
1.1儀器UPLClclass-XEVOTQ-XS超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀(美國Waters公司);3H20RI離心機(中國赫西);AE240電子天平(瑞士梅特勒);XW-80A旋渦混合器(中國HUXI);B8510E-DTH超聲波清洗器(美國必能信);Mili-QIntegral3超純水儀(美國Millipore公司);ACQUITYUPLCHSST3色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm，美國Waters公司)。
1.2試劑甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨、氯仿，HPLC級，美國Fisher公司。標準品:α-鵝膏毒肽(α-amanitin，純度≥90%，瑞士Alex);β-鵝膏毒肽(β-amanitin，純度≥90%，瑞士Alex);γ-鵝膏毒肽(γ-amaniyin，純度≥90%，瑞士Alex);羧基三羥鬼筆毒肽(phallisacin，50μg/mL，上海安譜實驗科技有限公司);羧基二羥鬼筆毒肽(phallacidin，純度≥95%，瑞士Alex);二羥鬼筆毒肽(phalloidin，純度≥90%，瑞士Alex)。1.3試驗方法
1.3.1標準溶液的配制。
1.3.1.1α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽標準儲備液的配制。分別精確稱取α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽、羧基二羥鬼筆5種標準物質1mg，精確至萬分之一，甲醇定容至10mL，濃度為100μg/mL。-20℃存儲。
1.3.1.2鵝膏毒肽和鬼筆毒肽混合標準使用液的配制。分別準確吸取1.0mLα-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽儲備液以及2.0mL羧基三羥鬼筆毒肽標準溶液于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，濃度為10mg/L。
1.3.1.36種毒肽混合標準系列的配制。分別吸取50、100、200、400、600、1000μL，用初始流動相定容至10mL，配制成濃度為50、100、200、400、600、1000μg/L的標準系列工作液。
1.3.2樣品前處理。
1.3.2.1提取。將新鮮野生菌樣品烘干(烘干溫度小于50℃)并打成粉末，精密稱取干燥粉末0.2g，置于50mL離心管中，加入甲醇10mL，振蕩渦旋1min，超聲提取10min，以10000r/min離心10min后，移取上清液于另一離心管中。殘渣中再加入10mL甲醇，渦旋混合均勻，再次超聲提取10min后以10000r/min離心，合并上清液。40℃旋轉蒸發近干，加2mL水溶解，洗滌3次，得提取液。
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1.3.2.2凈化。分別用2mL甲醇和純水淋洗活化PrimeOasisHLB固相萃取柱(3mL，60mg)，再將以上提取液過柱，用2mL含5%甲醇的水溶液淋洗2次，最后用2mL甲醇-乙腈混合溶液(V∶V=3∶2)洗脫。將洗脫液在40℃水浴中氮吹近干，用1mL初始流動相[甲醇-5mmol/L乙酸銨(0.1%甲酸)=90∶10]溶解定容，溶液過0.2μm濾膜后，待上機測定。
1.3.3分析條件。
1.3.3.1色譜條件。色譜柱為HSST3色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm，Waters公司);流動相A為5mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液，B為甲醇溶液;柱溫40℃;進樣量1.0μL;洗脫程序見表1。
1.3.3.2質譜條件。電噴霧ESI正離子模式;多反應監測(MRM);離子源溫度150℃;毛細管電壓2.83kV;脫溶劑溫度550℃;脫溶劑氣流量1000L/h;其他質譜參數見表2。
2結果與分析
2.1質譜條件的優化鵝膏毒肽屬雙環八肽，鬼筆毒肽是一類環狀七肽，其支鏈上有較多的羥基和甲基，容易接受電子而被離子化，故常采用正離子模式進行分析[6，12]。分別將6種毒肽的標準品用甲醇稀釋成500ng/mL，質譜儀直接進樣，在ESI正離子MS1Scan模式下，發現6種毒肽都有較強的M+1離子峰的出現，因此選定M+1為母離子，在DaughterScan模式下，分別找到每種毒肽的2個最佳子離子。最后優化錐孔電壓、碰撞能、脫溶劑氣流量、脫溶劑氣溫度等質譜參數，使離子化效率更高、離子強度最大。具體6種毒肽的母離子和子離子見表2。
2.2色譜條件的優化試驗選擇了UPLCHSST3色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，此色譜柱是與100%水相相兼容的C18柱，對保留和分離極性有機小分子具有較為理想的效果。該試驗選擇研究了4組流動相(A組水-乙腈;B組水-甲醇;C組0.1%甲酸水-甲醇;D組5mmol/L乙酸銨(0.1%甲酸)-甲醇)的分離效果，試驗表明，甲醇的分離效果比乙腈好，且使用5mmol/L乙酸銨(0.1%甲酸)作為水相時，目標物的離子峰強度較高，峰形較好。6種毒肽的標準提取離子圖詳見圖1
2.3樣品前處理方法的優化由于野生菌中成分復雜，脂肪、磷脂、肽類等雜質含量較高，該試驗采用了先溶劑提取、再固相萃取柱凈化的方法，先后比較了甲醇、水、乙腈3種溶劑的提取效果，結果表明，甲醇的提取效果較好，回收率高。
試驗考察了在使用HLB固相萃取柱凈化過程中，5%甲醇-氯仿和5%甲醇-水淋洗液的淋洗效果，結果表明，5%甲醇-氯仿淋洗液對HLB小柱中吸附的脂肪、磷脂等雜質具有較好的洗脫效果，但回收率較差。綜合考慮，該試驗采用5%甲醇-水作為淋洗液。
2.4線性范圍與檢出限6種毒肽的線性方程、線性范圍和線性相關系數見表3。以3倍信噪比(S/N≥3)估算檢出限(LOD)，6種毒肽的檢出限為30μg/kg。
2.5方法回收率和精密度取1份樣品，分別對6種毒肽進行低(50μg/kg)、中(200μg/kg)、高(600μg/kg)濃度加標試驗，結果發現(表4)，平均回收率分別為α-鵝膏毒肽99.5%～117.5%，β-鵝膏毒肽93.4%～107.0%，γ-鵝膏毒肽94.2%～110.1%，二羥鬼筆毒肽108.5%～119.8%，羧基二羥鬼筆毒肽93.5%～109.7%，羧基三羥鬼筆毒肽93.1%～106.5%;6次平行測定，變異系數(CV)在1.49%～7.77%。
2.6野生菌樣品檢測按上述方法對采集到的10個四川野生菌樣品進行前處理和檢測。在4號和6號樣品中檢出了α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽和二羥鬼筆毒肽3種毒蕈毒素，具體結果見表5，譜圖見圖2和圖3。
3結論
該研究基于超高效液相色譜-質譜聯用技術(UPLC-MS/MS)，采用甲醇提取，HLB固相萃取柱凈化，HSST3色譜柱分離，電噴霧ESI正離子模式和多反應監測(MRM)方式對6種毒蕈毒素的目標離子進行監測，外標法定量，建立了6種毒蕈毒素的快速、準確、選擇性好的測定方法。該方法與傳統的色譜法的檢測時間(20min)相比，大大縮短了檢測時間，同時具備更高的準確度、靈敏度和特異性，適用于野生菌中毒肽毒素的測定。——論文作者：薛康1，2，胡江濤1，2*，俞凌云1，2，劉菲1，2，馬麗1，2，龔婷婷1，2，華燚1，2，陳佳玥1，3
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