發布時間：2021-09-08所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:目的建立聚丙烯藥用滴眼劑瓶無菌檢查方法。方法洗脫液為0.9%無菌氯化鈉溶液，取樣量參照《中國藥典》四部通則1101醫療器械，瓶身中加入標示容量的0.9%無菌氯化鈉溶液，旋緊外蓋振搖30s，合并提取液后采用薄膜過濾法檢查;內蓋采用直接接種法檢查。結果無
摘要:目的建立聚丙烯藥用滴眼劑瓶無菌檢查方法。方法洗脫液為0.9%無菌氯化鈉溶液，取樣量參照《中國藥典》四部通則<1101>醫療器械，瓶身中加入標示容量的0.9%無菌氯化鈉溶液，旋緊外蓋振搖30s，合并提取液后采用薄膜過濾法檢查;內蓋采用直接接種法檢查。結果無菌檢查前處理研究中低濃度人工污染的枯草芽胞桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉和白色念珠菌的回收率均符合《中國藥典》要求;方法適用性實驗中試驗菌生長均良好。結論本法取樣量和樣品前處理方法科學有效，適用于聚丙烯藥用滴眼劑瓶的無菌檢查。
關鍵詞:聚丙烯滴眼劑瓶;直接接種法;薄膜過濾法;無菌檢查
聚丙烯滴眼劑瓶是目前國內常用的滴眼劑包裝形式[1]，這種塑料包裝材料在高溫下易變形，因此采用本材料包裝的無菌滴眼劑需采用非終端滅菌的無菌生產工藝進行無菌灌裝。聚丙烯滴眼劑瓶應在無菌灌裝前進行滅菌確保其無菌。藥品包裝材料的微生物污染風險直接影響藥品質量[2-7]，尤其是非終端滅菌無菌制劑的藥品包裝材料，為確保此類藥品的質量安全，必須嚴格控制包裝材料的微生物污染。2010年版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)中滴眼劑增加了無菌檢查，滴眼劑按無菌制劑進行生產，但現行《國家藥包材標準》僅規定創傷或手術滴眼劑瓶進行無菌檢查，與目前相關標準規定不符。且《國家藥包材標準》中無菌檢查僅簡單規定檢查方法，參照《中國藥典》無菌檢查法，導致聚丙烯滴眼劑瓶無菌檢查在實際操作中遇到如取樣量代表性等問題，且未按《中國藥典》要求進行方法適用性試驗，因此樣品前處理方法和無菌檢查方法的選擇等方面皆有待改善。由于聚丙烯滴眼劑瓶包含瓶身、外蓋及內蓋，包裝形式相互獨立，本實驗分別以滴眼劑瓶瓶身、外蓋和內蓋為對象進行無菌檢查方法的研究，通過取樣量、樣品前處理方法和無菌檢查方法適用性等研究，對本品的無菌檢查方法進行全面改善，提高聚丙烯滴眼劑瓶無菌檢查的操作性、適用性及使用安全性。
1材料與方法
1.1材料聚丙烯藥用滴眼劑瓶(規格:5ml，批號:171206;規格:8ml，批號:171220;規格:10ml，批號:161129)均由慈溪市觀城塑料包裝容器廠提供。
1.2儀器與試劑HTY-2000B型集菌儀(中國杭州泰林生物技術股份有限公司);FC502一次性使用集菌培養器(中國杭州泰林生物技術股份有限公司)。硫乙醇酸鹽流體培養基(FTM，批號:20190110)、胰酪大豆胨瓊脂培養基(TSA，批號:20180623)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(SDA，批號:20191010)、沙氏葡萄糖液體培養基(SDB，批號:20181223)和胰酪大豆胨液體培養基(TSB，批號:20190511)均由中國青島海博科技有限公司提供，以上培養基適用性檢查均符合中國藥典2015年版規定[8]。標準菌株和定量菌球:枯草芽胞桿菌[CMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(F)44102]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]和黑曲霉[CMCC(F)98003]由中國藥品生物制品檢定所提供。BioballMultishot550金黃色葡萄球菌、BioballMultishot550大腸埃希菌、BioballMultishot550枯草芽胞桿菌、BioballMultishot550白色假絲酵母和BioballMultishot550黑曲霉定量菌球均由法國梅里埃公司提供。
1.3方法
1.3.1菌液制備接種金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌至TSB中，33℃培養18h;接種枯草芽胞桿菌至TSA斜面，33℃培養18h;接種生孢梭菌至FTM中，33℃培養18h;接種白色念珠菌至SDB中，23℃培養2d;接種黑曲霉至SDA斜面，23℃培養7d。每種菌的新鮮培養物按要求稀釋制備菌懸液，分別計數，不同菌懸液每毫升含菌數均不大于100cfu。5種定量菌球均按使用說明書分別復溶至每毫升含菌約500cfu，取菌懸液各0.1ml分別計數。
1.3.2瓶身和外蓋無菌檢查前處理研究取3批已滅菌(規格:5ml、8ml和10ml)的聚丙烯藥用滴眼劑瓶，每批產品取25個樣品作為供試品，每種規格的供試品均進行低濃度人工污染金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、白色假絲酵母和黑曲霉。每種菌的接種同法操作5次，方法如下:將枯草芽胞桿菌定量菌球溶液0.1ml均勻滴灑至瓶內壁，旋上外蓋置50℃烘箱晾干;將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉和白色假絲酵母的定量菌球溶液各取0.1ml分別均勻滴灑至瓶內壁，之后輕旋上外蓋。
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取供試品標示容量的洗脫液(0.9%無菌氯化鈉溶液)緩慢注入已接種的樣品中，旋緊外蓋振蕩30s，將洗脫液薄膜過濾后取濾膜培養，作為試驗組。取未接種菌的樣品同法操作為供試品對照組。同時取上述5種菌的菌懸液各0.1ml分別計數作為菌液組。細菌接種至TSA平板于33℃培養3d，霉菌和酵母菌接種至SDA平板于23℃培養5d。
1.3.3瓶身和外蓋無菌檢查方法適用性試驗試驗組:取上述三批聚丙烯藥用滴眼劑瓶的瓶身和外蓋，每批樣品取120瓶，20瓶一組分成6組。每瓶中加入標示容量的0.9%無菌氯化鈉溶液，旋緊外蓋振蕩30s，合并20瓶的提取液，在提取液中加入“1.3.1”項制備的菌懸液1ml。按照《中國藥典》無菌檢查方法適用性試驗要求，6組提取液分別加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉。將提取液薄膜過濾后再加FTM或TSB至濾筒中。將上述濾筒分別置規定溫度培養5d，觀察結果。對照組:另取裝有同體積培養基的濾筒，分別加入等量不同試驗菌。同試驗組培養，觀察結果。
1.3.4內蓋無菌檢查方法適用性試驗試驗組:取上述三批聚丙烯藥用滴眼劑瓶的內蓋，每批樣品取120個，20個一組分成6組。將20個內蓋放入同一無菌瓶中，再加入FTM或TSB，并加入“1.3.1”項制備的菌懸液1ml。按照《中國藥典》無菌檢查方法適用性試驗要求，6組提取液分別加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉。將上述無菌瓶分別置規定溫度培養5d，觀察結果。對照組:另取裝有同體積培養基的濾筒，分別加入等量不同試驗菌。同試驗組培養，觀察結果。
2結果
2.1菌液計數結果取“1.3.1”項制備和稀釋的菌液，按平皿法測定菌落數，每株試驗菌平行制備2個平皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌、枯草芽胞桿菌、白色念珠菌和黑曲霉標準菌株的計數結果分別為42cfu/皿、42cfu/皿、33cfu/皿、19cfu/皿、28cfu/皿、62cfu/皿，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、白色念珠菌和黑曲霉定量菌球的計數結果分別為47cfu/皿、47cfu/皿、48cfu/皿、44cfu/皿、52cfu/皿。
2.2瓶身和外蓋無菌檢查前處理研究結果試驗組中的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、白色假絲酵母和黑曲霉5種菌在不同規格樣品中的回收率均>80%(表1)，符合《中國藥典》中“微生物回收”的要求，表明本品的無菌檢查前處理可采用“1.3.2”項前處理方法。
2.3瓶身和外蓋無菌檢查方法適用性試驗結果聚丙烯藥用滴眼劑瓶瓶身和外蓋的無菌檢查適用性試驗結果見表2。實驗組中試驗菌生長情況與對照管比較，結果均生長良好。表明本品瓶身和外蓋無菌檢查方法可以采用“1.3.2”項浸提法結合薄膜過濾法，且樣品的檢驗量在本試驗條件下無抑菌作用。
2.4內蓋無菌檢查方法適用性試驗結果聚丙烯藥用滴眼劑瓶內蓋的無菌檢查適用性試驗結果見表3。實驗組中試驗菌生長情況與對照管比較，結果均生長良好。表明本品內蓋的無菌檢查方法可以采用直接接種法，且樣品的檢驗量在本試驗條件下無抑菌作用。
2.5聚丙烯藥用滴眼劑瓶的無菌檢查法根據上述試驗結果，本品的取樣量可參照《中國藥典》四部通則(1101)醫療器械，內蓋等量直接接種于各管適量培養基中，瓶身加入標示容量的0.9%無菌氯化鈉溶液，將外蓋旋緊，振搖30s，合并提取液，經薄膜過濾法處理，照無菌檢查法(《中國藥典》四部通則1101)檢查，均應符合規定。
3討論
2015年版《國家藥包材標準》YBB00072002-2015中聚丙烯藥用滴眼劑瓶無菌檢查的取樣量為11個，仍按照2002年-2004年頒布的藥品包裝材料標準中規定的取樣量取樣未進行修訂。無菌檢查取樣量應考慮產品污染率和無菌檢查“通過”率，現行《中國藥典》無菌檢查的取樣量按照上述關系確定。當存在微生物污染時，取樣量越大，無菌檢查“通過”率就越低。鑒于取樣的代表性及科學性，本品無菌檢查的取樣量可參照《中國藥典》四部通則(1101)醫療器械，同時應考慮滅菌劑殘留等因素可能會造成無菌檢查的假陰性，應增加陽性對照的取樣量。由于聚丙烯藥用滴眼劑瓶批產量基本都在1000瓶以上，無菌檢查取樣量參照《中國藥典》四部通則(1101)醫療器械，出廠檢驗中接種每種培養基至少20瓶，其出廠檢驗量應為60瓶，上市監督檢驗量應為30瓶。
國外藥品包裝材料的無菌檢查方法主要也是參照醫療器械實施，產品性狀允許的情況下，采用直接接種法，無法采用直接接種的樣品選擇浸提法結合薄膜過濾法[9-10]，國內醫療器械的無菌檢查也參照這個原則[11-15]。由于浸提法結合薄膜過濾法存在微生物轉移損失和操作繁瑣造成假陽性的風險，在藥品包裝材料性狀允許的情況下，無菌檢查方法應優先考慮直接接種法。聚丙烯藥用滴眼劑瓶的組成包含瓶身、外蓋和內蓋，三部分包裝相對獨立。因構造和規格等原因，瓶身并不適用于直接接種法，需采用浸提法結合薄膜過濾法，而內蓋則可以采用直接接種法。由于聚丙烯藥用滴眼劑瓶的規格都相對較小，所以將洗脫液的量定為標示容量。無菌檢查取樣量參照《中國藥典》醫療器械后取樣量是之前的數倍，若振搖洗脫時間仍采用現行標準的1min，則60個瓶子需要振搖60min。無菌檢查振搖洗脫時間較長，操作繁瑣且容易造成污染，因此將每瓶的振搖時間定為30s，并進行低濃度人工污染金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、白色念珠菌和黑曲霉5種代表性菌株的回收率的考察，5種菌分別代表革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、芽胞菌、酵母和霉菌。樣品前處理研究表明振搖時間30s時，每種菌的洗脫回收率均符合要求，因此可將洗脫液定為標示容量以及振搖洗脫時間定為30s。本品內蓋相對獨立，為減少滴眼劑瓶組裝操作帶來的污染風險，采用直接接種法進行內蓋的無菌檢查。無菌檢查方法適用性試驗結果證明本研究建立的無菌檢查方法適用于聚丙烯藥用滴眼劑瓶。——論文作者：周燕麗
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