＂納米孔測序技術在傳染病防控中的應用進展 ＂

發布時間：2020-07-25所屬分類：醫學論文瀏覽：1次

摘 要： [摘要]新一代測序技術在病原體檢測中起著日益重要的作用，但讀長短、測序周期長、依賴實驗室設備環境等極大地限制了其在傳染病暴發的快速診斷與檢測中的應用。以納米孔測序技術為代表的第三代測序技術，不僅具有超長讀長、實時測序、低成本等優點，而且能夠

　　[摘要]新一代測序技術在病原體檢測中起著日益重要的作用，但讀長短、測序周期長、依賴實驗室設備環境等極大地限制了其在傳染病暴發的快速診斷與檢測中的應用。以納米孔測序技術為代表的第三代測序技術，不僅具有超長讀長、實時測序、低成本等優點，而且能夠對DNA/RNA直接測序，在病原體檢測方面的應用日益廣泛。本文針對納米孔測序技術在傳染病防控中的病原體檢測與分型、疫情溯源和流行規律研究等不同領域的應用進展進行簡要綜述。

　　[關鍵詞]納米孔測序技術;實時測序;傳染病;病原體檢測

　　近年來，新發突發傳染病成為威脅人類健康與公共衛生的重要因素，埃博拉、寨卡等疫情的不斷暴發給人們敲響了警鐘，這些病原體的快速檢測對于傳染病疫情的防控至關重要。新一代測序(next-generationsequencing，NGS)技術可以獲得病原體基因組序列信息，解決傳統分子生物學方法難以應對未知或變異病原檢測的瓶頸問題[1-4]，提高病原體識別確認能力，并通過基因組序列分析實現病原體的快速鑒定、精準分型、傳染源追溯及傳播演化規律分析，有效降低新發突發傳染病造成的公共衛生影響[5-6]。比如，利用高通量測序預測H1N1的傳播流行規律，與傳統的流行病學預測結果一致，為流感防控提供了重要參考[7]。在埃博拉疫情中應用高通量測序研究埃博拉病毒的演化規律，為深入的流行病學調查提供了關鍵信息[8]。

　　然而，現有的NGS技術平臺體積大不易搬運，測序周期長，且依賴于大量實驗室輔助設備和專業人員操作，在面臨疫情暴發或嚴重感染性疾病的處置中難以實現快速實時檢測，無法應對致病病原識別時效性的需求[9]。且受限于短讀長，NGS測序難以獲得具有重復序列的復雜基因組結構的病原體序列全長，不利于后續變異和溯源分析[10-11]。納米孔測序技術利用堿基穿過納米孔時電信號的改變實現實時測序[12]，OxfordNano⁃poreTechnology(ONT)公司基于該技術研發了掌上測序儀MinION，僅有U盤大小，可通過筆記本電腦USB接口實現供電和數據生成讀取，不受外界環境和輔助設備限制，實時獲得數據，按需終止測序[13]。MinION測序也無須對核酸進行片段化，最快可在10min內完成樣本建庫，并可獲得更長讀長，目前單條序列讀長已達到882kb[14]。引起感染的病原體種類極其復雜，使用宏基因組測序可以同時檢測樣本中的病毒、細菌、寄生蟲等病原體[15]，MinION在超長讀長、實時測序和高便攜性等方面的優勢，使其在病原體檢測和疾病暴發監測方面的應用日益廣泛。

　　1納米孔測序技術在病原體檢測與分型中的應用

　　Greninger等[16]首次利用MinION對4例患者血液樣本進行實時宏基因組病原檢測，病毒含量為107~108拷貝/mL時，4~10min即可完成對埃博拉病毒和基孔肯雅病毒的檢測;病毒含量為105拷貝/mL時，40min內檢測到丙型肝炎病毒，且與二代測序儀MiSeq的結果一致。該方法可將“樣本~檢測”的整個周轉時間縮短至6h以內，有效縮短了對傳染性疾病的早期診斷的時間。

　　引起肝膿腫的病原體種類繁多，目前的診斷主要依賴于病原體培養，周期長且常導致培養結果的偏倚。Gong等[17]對非培養肝膿腫樣本進行納米孔測序以鑒定引起感染的病原體，通過差速離心去除人源完整細胞，借助DNA酶消化去除人源線性DNA，對處理后的樣本進行MinION測序，并用ONT公司的What'sInMyPot(WIMP)生物信息分析流程進行實時病原體鑒定，在4h內識別出樣本中的肺炎克雷伯菌2個亞型，并進一步發現了emrB、macB等7個耐藥基因，極大地縮短了病原體鑒定的時間，為臨床感染實時診斷與抗生素用藥提供了重要參考。

　　蚊子是病原體的重要傳播媒介，但其攜帶的病原含量極其有限，為病原監測帶來極大的困難。Batovska等[18]從一例感染羅斯河病毒的白紋伊蚊中直接提取RNA，采用MinION和MiSeq對反轉錄產物進行測序，前者成功測定病毒基因組全長，且2個平臺測序準確率均達到98%以上。美國佛羅里達州研究者采用相似方法，對收集的20例庫蚊樣本混樣后進行現場測序，檢測到委內瑞拉馬腦炎病毒，并基于序列分析確定為大沼澤地病毒亞型[9]。該研究僅需手持式qPCR儀、MinION測序儀及筆記本電腦，即可在現場完成對環境樣本的測序和生物體的種屬鑒定，對儀器設備的要求低，且無需額外PCR擴增步驟，為現場快速生物監測提供了可借鑒的方法。

　　瘧疾作為一種重要的蚊媒傳播的寄生蟲傳染病，現有實驗室診斷方法仍難以滿足現場快速準確的檢測需求。Imai等[19]針對5種可引起人類瘧疾的瘧原蟲的18SrRNA序列設計特異性引物，對環介導等溫擴增后的產物進行MinION測序，對瘧原蟲最低檢測限達到每個反應體系10~100拷貝，與巢式PCR法對瘧原蟲種屬鑒定結果一致，但該方法對實驗設備要求低，適于在實驗室條件匱乏的地區開展檢測。

　　病毒遺傳信息多以RNA為載體，現有測序技術須將RNA反轉錄為cDNA，易引入堿基匹配錯誤或反轉錄偏倚，也難以了解RNA原始狀態[20]。ONT公司研發團隊[21]用MinION首次完成了對酵母中poly(A)+RNA的直接測序，無須進行反轉錄或擴增就可直接獲得酵母全長鏈特異性的RNA序列。研究者進一步對該樣本RNA反轉錄后的cDNA分別進行MinION和MiSeq測序，3次測序結果與酵母轉錄組數據的匹配均在79%以上，且RNA直接測序與反轉錄后測序具有較高的相關性。Keller等[22]針對甲型H1N1病毒基因組3'端高度保守區設計探針，用MinION對捕獲的病毒原始RNA直接測序，獲得influenzarA/PuertoRico/8/1934毒株完整的編碼序列，隨后又用該方法對甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1和H7N9進行RNA直接測序，與反轉錄后PCR和MiSeq測序結果的一致性達98%，且超過96%的序列可以匹配到對應病毒基因組，表明MinION在病毒RNA直接測序方面的巨大潛力，為進一步直接研究病毒RNA進化變異和堿基修飾提供了重要參考。

　　長讀長測序為病原體鑒定提供更高的分辨率。Peritz等[23]對大腸桿菌7個血清型的混合DNA文庫進行納米孔測序，以測試MinION測序對大腸桿菌的分型與鑒別能力。測序結果顯示共獲得63297條有效序列，平均讀長為5.9kb，過濾掉小于4.0kb的序列后剩余44245條序列。將這些序列與大腸桿菌O抗原基因簇數據庫比對，其中58條序列特異性匹配到7種血清型的O抗原，且每一個O抗原簇至少匹配4條序列。通過與大腸桿菌全基因組數據庫比對，顯示5096條(11.5%)序列為特異性匹配序列，這其中99.6%的序列與該7種血清型匹配，僅0.4%的序列與其他血清型匹配。該方法表明MinION測序對于復雜混合樣本的病原體分型依然具有較高的分辨率，在病原體快速分型中具有明顯優勢。

　　16SrRNA基因(~1500bp)與rrn操縱子(16S-ITS-23S)是進行微生物種屬鑒定的重要標志，二代測序由于讀長短難以對細菌進行更精細的分型，采用納米孔測序獲得16SrRNA和rrn的全長序列，也有助于更全面和更快地檢測復雜生態系統中的微生物物種多樣性。Cuzco等[24]利用MinION分別對葡萄球菌樣本的16SrRNA和rrn進行測序，發現兩者的擴增子比對到正確物種的比例分別達~68%和~98%。為了研究微生物多樣性，研究者設計新的多位點方法并利用MinION平臺對模擬樣本進行16S擴增子測序，在單次測序中獲得約380萬條序列，完成了對模擬樣本中超過90%的16SrRNA基因序列的重建，檢測到20個不同物種，并計算出所有物種的相對豐度[25]。該課題組進一步結合多位點與長擴增子測序方法，使用引物對樣本中的rrn區域進行PCR擴增后用納米孔測序，最終分析和提取67000多個細菌基因組中的rrn序列，完全重建了模擬群落中的微生物多樣性，且其分型準確率優于單獨基于16S、ITS或23S的分型結果[26]。

　　2納米孔測序技術在疫情溯源中的應用

　　2014~2016年西非埃博拉疫情導致11299人死亡，引起了全世界的關注�？焖佾@得基因組信息有助于闡明埃博拉病毒的傳播規律，然而疫區地處偏遠，缺乏良好的實驗室和樣本運輸的條件。Loman團隊[27]首次將MinION帶到幾內亞疫情現場，建立基因組實時監測系統，收集并完成142例埃博拉患者樣本測序，最快可在24h內獲得測序結果�；�于測序數據，研究者發現幾內亞流行的病毒主要屬于GN1和SL3種系，且這2個種系也出現于塞拉利昂，提示病毒在2個國家之間發生傳播。Hoenen等[28]則在利比里亞開展埃博拉病毒現場測序，獲得8份樣本的埃博拉基因組序列，發現該地區的病毒序列與塞拉利昂或幾內亞的病毒序列存在明顯差異，但與利比里亞其他地區序列屬于同一簇，進化分析結果顯示該地區的埃博拉病毒可能由同一個或親緣關系較近的祖先進化而來，為疫情防控提供了重要的科學依據。

　　2015年巴西暴發寨卡疫情，隨后超過45個國家報道了寨卡病毒在本國的傳播。為獲得寨卡病毒的基因組序列及傳播規律，針對寨卡感染樣本中病原含量低、背景復雜、直接測序難以獲得病毒序列全長的問題，研究者基于寨卡病毒特定編碼序列設計了引物池，通過多重PCR進行富集擴增，建立基于MinION的現場測序方法，從而在1~2d內獲得病毒的一致性序列，該方法在病毒拷貝數低至50時仍能有效檢測到病毒[29]�；�于上述方法，Faria等[30]進一步發起“巴西寨卡病毒實時分析計劃”，利用MinION部署移動實驗室，直接對臨床樣本進行現場測序，獲得了54株寨卡病毒基因組序列，發現疫情毒株與來自東南亞及太平洋地區的寨卡病毒亞洲基因型親緣關系較近，推測寨卡病毒從巴西東北部向中美洲、加勒比海及南美洲其他地區傳播。后續的地理學分析結果和前述基礎病毒增殖數量預測結果一致，為研究病原體的傳播軌跡和進化規律提供了更為及時和精確的信息[31]。

　　2018年尼日利亞拉沙熱疫情暴發，拉沙病毒高變異性為基于PCR的擴增測序帶來極大困難。為了明確毒株變異特征以及疫情暴發的分子流行病學機制，研究者們[32]通過隨機反轉錄和單引物擴增法對36例臨床樣本中提取的病毒RNA進行擴增，并采用MinION進行現場實時測序與分析，發現疫情毒株主要為拉沙病毒Ⅱ型和Ⅲ型，系統發育學分析顯示這2種病毒亞型主要存在于嚙齒動物中，推測此次疫情為散發的人畜共患病傳播事件，排除了拉沙病毒在人際間大規模傳播的可能，指導衛生部門將工作重點從切斷人間傳播轉向嚙齒動物控制、環境衛生和食品安全等方面，為疫情防控指明了正確的方向。

　　醫院中病原體感染傳播可能導致重癥患者死亡，造成社區范圍內的大規模播散，病原體的快速檢測與分型是院內感染防控的首要環節。2015年英國伯明翰一家醫院暴發了沙門菌疫情，超過30人感染，感染來源難以確定。Loman等[33]用MinION測序儀分別對腹瀉患者糞便樣本和環境拭子樣本分離的菌株進行測序，在20min內確定感染病原體為腸炎沙門菌，在2h內完成沙門菌與感染暴發間的關聯分析，發現其中一例測序菌株與其他疫情菌株歸屬于同一進化分支，而另一例非疫情相關菌株歸屬其他分支，綜合后續Il⁃lumina測序結果，37例疫情菌株中，8例來自醫院工作人員，3例來自病房內的無癥狀攜帶者，提示這是一起沙門菌的院內感染暴發。進一步研究發現，最終暴發菌株確定為PT14b型，MLVA分型為2-11-9-7-4-3-2-8-9，且暴發菌株的MLVA分型與先前的法國、奧地利、德國暴發的腸炎沙門氏菌PT14b僅有1個位點的差異，最終確定源頭來自德國的一家雞蛋生產商，提示可能存在著歐洲不同國家間腸炎沙門菌的傳播，為及早采取措施控制疫情傳播爭取了寶貴的時間。

　　3納米孔測序技術在傳染病流行規律研究中的應用

　　基孔肯雅病毒自2013年在加勒比地區首次檢測到后，已經傳播到51個美洲地區國家，然而關于其基因多態性與動態性變化的流行規律缺乏系統研究。Naveca等[34]針對2014~2018年在巴西亞馬孫地區暴發的基孔肯雅病毒疫情，使用MinION測序獲得了20例基孔肯雅ECSA基因型(CHIKV-ECSA)病毒株的基因組，分析發現亞洲基因型雖然在2015年傳入巴西地區，但此次疫情是由起源于巴西東北部的ECSA基因型引起的，且ECSA基因型正在取代亞洲基因型成為優勢亞型。進一步的流行病學分析表明，病毒基本再生數為1.66，據此估計該地區約39%的人口感染基孔肯雅ECSA基因型。另外，研究者發現Google搜索的活躍度與當地實驗室確認的基孔肯雅病毒感染病例之間存在密切聯系。這一研究顯示出將傳統監測與便攜式納米孔基因組測序技術和數字流行病學相結合的潛力，為探索病原體的流行規律提供重要信息。

　　黃熱病毒自然情況下在原始森林中循環與傳播，巴西的黃熱病毒感染病例近年來明顯上升，然而黃熱病毒在人群間的傳播規律仍不明確。研究者們[35]使用納米孔測序對感染人類和非人靈長類動物的黃熱病毒株進行全基因組測序，結合流行病學、地理學和基因組學數據，發現病毒的傳播與人類病例的年齡和性別分布密切相關，且黃熱病毒在自然界傳播的地域范圍不斷擴大，引起疫情的病毒株在感染人之前便已在非人靈長類動物中循環傳播，最終導致2016年人群中疫情的暴發�；�于納米孔測序技術的黃熱病毒傳播實時監測體系，有助于制定消除未來黃熱病毒流行的全球戰略。

　　多重耐藥編碼質粒是細菌間抗生素耐藥基因傳播的重要介質，而大量重復序列的存在導致難以通過二代測序獲得質粒完整序列，給解析病原菌耐藥的流行傳播規律帶來極大困難。為研究攜帶NDM-1基因的細菌在醫院內和醫院間的傳播規律，Phan等[36]收集了羅馬尼亞2家醫院的粘質沙雷菌、肺炎克雷伯菌和陰溝腸桿菌菌株，結合MinION和IlluminaHiSeq測序結果，獲得了9例樣本的完整質粒序列，發現其結構均與質粒pKOX_NDM1類似，為研究耐藥質粒在不同物種間傳播的分子流行病學機制提供了重要參考。

　　4結語

　　納米孔測序為病原體快速檢測尤其是疫情現場判別提供了新的思路，但其測序數據信噪比低，導致測序錯誤率高，須通過提高測序深度或與二代測序平臺聯用提高準確率[37-38]。此外，測序需要較高的核酸質量，探索適于不同類型臨床樣本的現場處理和測序方案，減少對實驗室設備的依賴，進一步優化完善樣本處理與文庫制備操作流程，有助于提高快速檢測的時效性和準確性。我們課題組采用樣本混合富集的方法，對腺病毒感染非培養樣本進行了直接測序，在3h內即獲得了腺病毒完整基因組，為疫情實時檢測提供了寶貴經驗[39]。ONT公司近期推出的VolTRAX實現了測序文庫構建的自動化，進一步縮短了樣品文庫制備時間，但目前還在試用階段[40]。英國倫敦大學學院(UCL)啟動了PATHSEEK項目，研究如何對臨床樣本中的特定病原體進行自動化靶向富集和測序分析，并對流感病毒、人巨細胞病毒、結核分枝桿菌等病原體的臨床檢測進行了應用評估，為復雜樣本處理提供了重要參考[41]。

　　MinION作為一種新型的測序技術，具有便攜性、實時性等諸多優勢，且無須對樣本進行PCR擴增，因此降低了樣本起始量和測序錯誤率，實現了真正的單分子測序。不僅可以實時測序，也可以“剔除”不感興趣的序列，對感興趣的序列持續進行測序，以便于從樣本宿主背景中獲取更多的病原序列信息[42]。基于EPI2ME平臺開發的生物分類工作流WIMP[24]可以對測序數據中細菌、病毒、真菌、古細菌等進行識別，也為臨床病原體檢測提供了可定量化實時分析工具。隨著平臺及分析工具的不斷發展與完善，納米孔測序技術將在現場病原體檢測、臨床微生物診斷以及實時病原監測等領域中具有日益廣闊的應用前景。——論文作者：林彥鋒1，2，李鵬2，劉雪林2，宋宏彬2

　　納米孔測序技術在傳染病防控中的應用進展來自期刊：《生物技術通訊》雜志是由軍事醫學科學院生物工程研究所主辦生物技術類學術期刊。是中國人民解放軍唯一的、也是中國國內不多的全面反映生物技術及分子生物學、分子遺傳學研究進展，及其在生物醫學、工業、農業、環保、衛生、食品等各領域應用進展的學術性刊物之一。是中國人民解放軍唯一的、也是中國國內不多的全面反映生物技術及分子生物學、分子遺傳學研究進展，及其在生物醫學、工業、農業、環保、衛生、食品等各領域應用進展的學術性刊物之一。