發布時間：2020-06-09所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：脂質不僅是細胞膜的主要組成部分，還參與一些生命活動如能量存儲、信號傳導等，在生命體中發揮著重要作用。近年來，越來越多的研究表明脂質的變化與一些重大疾病的發生發展密切相關，脂質組學研究對理解疾病的發生機制及過程具有重要意義。在脂質分析
摘要：脂質不僅是細胞膜的主要組成部分，還參與一些生命活動如能量存儲、信號傳導等，在生命體中發揮著重要作用。近年來，越來越多的研究表明脂質的變化與一些重大疾病的發生發展密切相關，脂質組學研究對理解疾病的發生機制及過程具有重要意義。在脂質分析過程中，由于樣品基質的干擾或被分析物濃度的限制，通常需要對樣品進行前處理，以得到最佳的分析性能。該文綜述了脂質組學分析中的樣品前處理技術，包括脂質的提取方法(如液液萃取、固相萃取等)和針對不同類脂質的化學衍生化技術在各領域，尤其是生命分析和代謝組學中的應用，并對脂質組學分析中的樣品前處理技術的發展進行了展望。
關鍵詞：脂質組學;樣品前處理;脂質提取;化學衍生化;綜述
作為代謝物的一大類重要組成部分，脂質在生命體中扮演著重要作用，如磷脂雙分子層是構成細胞膜的基本骨架，可維持細胞的完整性和相對獨立性;脂肪酸和甘油三酯是多種細胞的能量來源，維持細胞的基本活動與功能;許多脂質分子如類花生酸、溶血磷脂、內源性大麻素等可作為二級信號傳遞分子，參與細胞信號傳導等。脂質組學(lipidomics)作為代謝組學(metabolomics)的一個重要分支，是對脂質及其相關結構與功能進行研究的科學，其定義為“對脂質分子種屬及其在生物學上的作用，涵蓋脂類代謝、功能蛋白質表達以及基因調控等因素的全面描述”[1]。根據脂質化學結構的差異，可將其分為8大類[2]：脂肪酰類(fattyacyls，FA)、甘油酯類(glycerolipids，GL)、甘油磷脂類(glycero-phospholipids，GP)、鞘脂類(sphingolipids，SP)、固醇類(sterollipids，ST)、異戊烯醇類(prenollip-ids，PL)、糖脂類(saccharolipids，SL)和聚酮類(polyketides，PK)等。每一類型的脂質由于極性頭基、碳鏈長度或不飽和度的差異又可形成不同的結構，由此組成種類繁多、性質各異的脂質分子。越來越多的研究表明，脂質的合成或代謝異常與多種疾病密切相關，如癌癥[3]、阿茲海默癥[4]、動脈粥樣硬化[5]等。脂質組學研究已成為生命科學研究領域的熱點，面對復雜的脂質組分，發展準確、靈敏、可靠的脂質組學分析方法顯得尤為重要。
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目前，質譜(MS)已成為脂質組學研究中最有效的技術手段之一�；贛S的分析方法主要可分為3種：利用MS直接進樣檢測的“鳥槍法”，與其他分離技術如液相色譜(LC)、氣相色譜(GC)、毛細管電泳(CE)等結合的聯用方法，以及可實現樣品空間分布的質譜成像(MSI)方法。脂質組學研究對象通常是基質復雜的生物樣品，如血清、血漿、尿液、組織等，除MSI方法外，在進行分析前往往需要對樣品進行富集和提取。提取后的脂質在MS檢測時可能仍會面臨靈敏度低等問題，這就需要對樣品做進一步處理，化學衍生化是解決該類問題的有效手段之一。本文針對脂質組學分析中的樣品前處理技術，以脂質化合物提取方法與衍生化技術為重點進行了評述，并對其發展趨勢進行了展望。
1脂質的提取與富集技術
通常生物樣本采集后直接利用液氮快速冷凍，之后放入低溫(如-80℃)環境儲存，從而盡量減少樣品中各類物質發生改變[6]。在進行分析前，液體樣品在4℃條件下復溶，然后進行充分混合;固體樣品則可借助研缽或勻漿機，通過加入適當溶劑完成混合[7]。
常用的脂質提取技術主要包括液液萃取(LLE)與固相萃取(SPE)兩種方式。由于LLE可提取出較為全面的脂質分子，適用于非靶向全脂分析;SPE過程使樣品經過分離和富集步驟，進一步除去干擾物質，提高被分析物的濃度，更適用于某一類或某幾類脂質分子的靶向代謝組學分析。
1.1液液萃取
生物樣品中蛋白質的存在會影響脂質分析方法的精確度與準確性，如不提前去除，可能縮短儀器的使用壽命[8]。為了減少樣品損失，前處理步驟應盡可能少，相對簡單的操作是將蛋白質沉淀與脂質提取一步完成。Zhao等[9]提出一種向血樣(血清或血漿)中加入過量甲醇的簡單提取方法，用來分析人血中的磷脂和溶血磷脂。t’Kindt等[10]用同樣的方法提取了人皮膚中的神經酰胺，其中一部分利用電噴霧電離-質譜(ESI-MS)的負離子模式進行分析，而另一部分提取液經SPE提取后在正離子模式條件下進行分析，兩部分結果總計鑒定到264種神經酰胺分子。
由于復雜的脂質分子間極性存在巨大差異，一種溶劑的提取方法已不能滿足全脂分析的需求，混合溶劑的單相提取方法得到了發展。Pellegrino等[11]開發了一種全脂分析方法，他們向50μL血清中加入1mL甲醇-甲基叔丁基醚(MTBE)-氯仿(1.33∶1∶1，v/v/v)混合溶液(MMC)，經過渦旋、離心后用LC-MS進行分析。結果表明，血清中9種脂質的回收率接近100%。Calderón等[12]在Sarafian等[13]工作的基礎上，以宮頸癌Hela細胞為分析對象，比較了兩種單相異丙醇-水混合體系(75∶25，v/v和90∶10，v/v)與傳統兩相萃取體系(Bligh-Dyer法[14]和Matyash法[15])的性能。結果發現，異丙醇-水(90∶10，v/v)的萃取效果與Matyash法相當，并且優于另兩種方法。除此之外，研究人員報道了多種單相萃取體系用于脂質組學分析，如氯仿-甲醇(2∶1，v/v)[16]、正丁醇-甲醇(1∶1，v/v)[17]體系等。Jurowski等[18]就用于脂質組學分析的單相混合溶劑進行了綜述。
LLE是脂質組學中使用最廣泛的萃取方法。與單相溶劑萃取體系不同，LLE利用被分析物在兩種互不相溶的溶劑中分配系數的差異實現不同物質的分離。脂質組學分析中應用最多的LLE方法有3種：Folch法[19]、Bligh-Dyer法和Matyash法。其中Folch法使用氯仿-甲醇-水(8∶4∶3，v/v/v)混合溶劑對生物樣品進行全脂提取，Bligh-Dyer法在上述方法的基礎上進行了改進，使用相同溶劑體系但不同體積比(2∶2∶1.8)，以此減少溶劑用量，縮短提取時間，并且還可減少有毒試劑氯仿的使用。氯仿與甲醇的混合體系能在多種復雜基質中非選擇性地提取出各種脂質分子，水相的加入可以增強相分離，減小脂質在水相中的溶解度，從而提高萃取效率。為了減小溶劑毒性，Carlson[20]用二氯甲烷替代氯仿進行血清和組織的脂質萃取。然而，上述方法在進行脂質提取時，含有脂質的有機相位于兩相溶液的下層，無論是直接移取下層溶液還是去除上層液體，都面臨可能造成溶液污染或樣品損失的問題。
Matyash等[15]使用低密度的MTBE與甲醇和水組成的混合溶液(10∶3∶2.5，v/v/v)作為萃取溶劑對鼠腦和人血漿進行全脂分析，并與Folch法和Bligh-Dyer法進行對比。結果表明，在4種不同的基質中，Matyash法的回收率與其他兩種方法的結果相當甚至更好。使用MTBE代替氯仿，降低了溶劑的毒性和致癌性，并且含脂質的有機相位于兩相溶液的上層，簡化了相分離步驟。Lfgren等[21]提出了另一種基于丁醇和甲醇的無氯仿體系(BUME)，他們向75μL血漿中加入300μL丁醇-甲醇(3∶1，v/v)溶液后，再加入300μL庚烷-乙酸乙酯(3∶1，v/v)溶液和300μL1%(v/v)乙酸水溶液進行全脂萃取。整個萃取過程在96孔板中進行，在60min內即可實現96份樣品的提取。該方法分析速度快，自動化程度高。
近幾年來，基于LLE方法的脂質組學在多個領域開展應用，所用的萃取體系多是在上述傳統方法基礎上進行改進。Buyer等[22]在Bligh-Dyer溶劑的基礎上加入了0.25mol/L碳酸氫銨，以萃取分析土壤中的磷脂脂肪酸(PLFA)，這種揮發性鹽的加入不僅使PLFA的萃取效率提高，也提高了土壤中其他代謝物的提取效率。Sostare等[23]則通過改變Matyash溶劑的體積比(MTBE-甲醇-水的體積比由10∶3∶2.5改為2.6∶2.0∶2.4)提高分析方法的萃取效率和重現性。Ren等[24]利用4種方法提取微藻樣品中的脂質時，在每種方法的兩步提取過程間增加一步純水相提取步驟。結果表明，增加水相處理步驟后脂質萃取效率大大提高，提取的脂質中甘油三酯的比例有所提高，這在生物柴油的生產領域非常有用。Ulmer等[25]考慮到上述3種最常用方法的萃取溶劑體積可能會隨樣品基質的不同有所改變，他們以人血漿樣品為研究對象，對3種方法所用樣品與萃取溶劑的體積比分別進行了優化。除此之外，不同方法對相同樣品萃取效果的比較也有諸多研究報道[11，12，26，27]。
1.2固相萃取
SPE是利用不同物質在固液兩相中相互作用的差異實現分離的，其具體操作是先使被分析物吸附到固定相上，然后使用不同洗脫能力的溶液(流動相)分步洗脫，實現樣品的分離、純化與富集，SPE常被用于脂質的萃取。一般來說，SPE常用于LLE之后，目的是去除萃取液中的干擾物質或特異性富集某一類或某幾類脂質，以用于靶向脂質組學分析。
Hewelt-Belka等[28]先用Bligh-Dyer法對母乳進行全脂萃取，上層水相含有的極性代謝物通過親水相互作用色譜(HILIC)-MS進行分析，另一份樣品用HybridSPE-Phospholipid柱處理，將含有磷脂的洗脫部分與LLE的下層有機相合并后進行RPLC-MS分析。該方法可同時獲得母乳中高豐度甘油糖脂與低豐度甘油磷脂和鞘脂類的信息，是一種可對母乳進行全脂分析的半定量方法。Flieger等[29]使用Cu2+修飾的硅膠柱用于血漿樣品中磷脂的去除。在探究去除磷脂方法的方面，Warren[30]用硅膠作為固定相，氯仿、丙酮、甲醇依次進行洗脫，驗證甲醇洗脫液中是否只含有磷脂，結果發現甲醇洗脫下來的部分除含磷脂外，還有多種其他極性脂質。目前已有多種商用化SPE固定相用于脂質組學分析，常用的為硅膠基底，如C8柱或C18柱以及非鍵合或鍵合了氨基、氰基、二羥基或氨丙基的硅膠柱等[31]。硅膠柱和氨丙基柱常被用于分離中等極性和極性脂質，而C8柱和C18柱則被用于從水相樣品的極性物質中分離腦苷脂、神經節苷脂和脂肪酸等物質[31]。
相對于SPE，固相微萃取(SPME)使用溶劑量少，分析速度快。SPME常使用一根帶有涂層的纖維用于萃取分析物，基于靜電作用、離子交換作用、疏水相互作用等作用力，目前使用較多的涂層有聚丙烯腈(PAN)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚苯胺(PANI)等[32]。Garwolińska等[33]將一根表面修飾PAN-C18的纖維用甲醇-水(1∶1，v/v)混合溶劑活化20min后直接插入1mL母乳中，經過5min吸附后，再放入100μL異丙醇中進行洗脫，5min后取出該纖維，洗脫液直接用于LC-MS分析。該方法分析速度快，操作簡便，適用于母乳的全脂分析，并且該方法通過MS的輪廓分析可以區分母乳、配方奶粉和牛奶樣品。Deng等[34]則使用一種生物相容性材料作為探針的涂層，開展原位、體內和微尺度的脂質組學研究。他們將表面修飾有親水性殼聚糖聚合物的鎢針直接插入斑馬魚、大型溞和單個真核細胞內進行萃取，洗脫后用納升電噴霧電離(nanoESI)-MS進行檢測。與傳統的鳥槍法相比，該方法檢測到的脂質結果相似，但樣品消耗量少，分析時間短。
SPME技術常與GC或GC-MS結合用于揮發性物質的分析，如頂空-GC(HS-GC)的進樣針首先在一定條件下對固體、液體或氣體樣品進行萃取吸附，進而在進樣口實現洗脫/解吸附并完成進樣。此外，SPME也可與全二維GC(GC×GC)分析結合，借助高靈敏的質譜檢測技術用于環境污染物和農用化學品的檢測[35]。目前，SPME結合GC-MS已成功用于多種樣品中脂肪酸或脂肪酸酯的分析，如水果[36]、牛奶[37]、白酒[38]等。盡管SPE/SPME方法所用小柱或涂層容易達到飽和，成本較高，但具有樣品和溶劑消耗少、分析速度快、易于自動化的優點，適用于極少量樣品、大規模樣品及原位分析。
1.3其他萃取技術
近年來，除了LLE與SPE方法外，許多其他方法也已用于脂質組學樣品前處理中，如微波輔助提取法(MAE)、超聲輔助提取法(UAE)、超臨界流體提取法(SFE)等。MAE主要利用微波的能量在萃取過程中提高溫度和壓力，從而加快萃取速度，提高萃取效率，并且減少有機溶劑的用量[39]。由于萃取過程中溫度的升高，MAE可能造成熱不穩定性物質的分解。deMorais等[40]在人血漿樣品的脂質提取中，比較了5種LLE方法與MAE法。結果顯示，MAE與Folch法的脂質萃取總量相當，但用GC檢測到的24種脂肪酸含量前者低于后者，說明MAE適合于定性而非定量分析。Pan等[41]以一種離子液體為溶劑，用MAE與傳統LLE相比較，檢測結果相近但萃取速度大大提高。這都說明在利用MAE萃取脂質時，需要根據待測物的性質進行條件優化，以期實現最佳的萃取效果。
UAE是利用超聲波產生的機械振動、擴散等效應加速兩相間物質傳遞，從而實現萃取的技術[42]。與MAE不同的是，UAE過程中不會升溫，有利于熱不穩定性物質的分析。此外，UAE可與LLE相結合，進一步提高樣品中被分析物的萃取效率。Liu等[43]分析了超聲對人血清樣品的萃取及衍生過程的影響，結果表明，萃取及衍生過程均在超聲條件下進行時，測得的脂肪酸信號增加了5%～60%。
超臨界流體是指溫度與壓力均處于臨界值以上的流體，具有低密度與高擴散性的特點，適合于樣品的萃取或分離。SFE中最常用的超臨界流體是CO2，其臨界壓力(7.4MPa)與溫度(31℃)均較低，并且無毒害，易于去除。超臨界CO2的極性與戊烷相近，適合于疏水性物質的萃取。用甲醇、二氯甲烷或水作為添加劑，SFE也可用于極性物質的萃取[44]。利用SFE的非破壞性，Deviese等[45]用反應曲面法優化出SFE的最佳條件，用于考古陶罐表面的脂質分析。與傳統LLE相比，萃取效率得到提高，并且兩種萃取方法得到的不飽和與飽和脂肪酸的比值不同。SFE作為一種新型的萃取分離技術，其萃取效率高，無污染，操作方便，適合于生物、食品、藥物等樣品的分析[46-48]。——論文作者：宋詩瑤，白 玉，劉虎威
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