發布時間：2020-06-09所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:以麥冬甾體皂苷為模型藥物，以明膠為載體原料制備載藥微球，并研究其對成骨細胞的調控作用。首先采用雙乳化-化學交聯技術構建載藥明膠微球，再對其釋藥特點、調控成骨細胞生理功能的效應等方面開展研究。結果發現構建的載藥微球不僅有效緩解藥物突釋現
摘要:以麥冬甾體皂苷為模型藥物，以明膠為載體原料制備載藥微球，并研究其對成骨細胞的調控作用。首先采用雙乳化-化學交聯技術構建載藥明膠微球，再對其釋藥特點、調控成骨細胞生理功能的效應等方面開展研究。結果發現構建的載藥微球不僅有效緩解藥物突釋現象并延長藥物釋放時間，而且可以有效刺激成骨細胞增殖、堿性磷酸酶分泌及礦化，促其向骨組織分化。
關鍵詞:明膠;麥冬皂苷;微球
目前甾體皂苷類化合物的應用及研究領域主要集中在中樞神經損傷的治療方面，甾體皂苷類化合物應用于骨缺損治療領域的研究報告還很少見。江洋珍等[1]研究了薯蕷皂苷元(麥冬甾體皂苷的主要水解產物，分子式:C27H42O3，相對分子質量:414.63Da)對大鼠成骨細胞增殖、分化的影響。研究發現，在培養液中添加質量濃度(0.015～0.150μg/mL)的薯蕷皂苷元后，成骨細胞增殖、分泌堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)的水平明顯提高。
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與此同時，構建具有時空控制釋放特點的載藥微球已成為一個新的研究方向[2-3]。連續梯度的化學信號能引起濃度依賴性的細胞特異類型反應，從而引起不同的生物學作用[4]。這種微球對于骨缺損的修復具有較好的藥物緩釋作用。微球可直接植入骨缺損部位以刺激骨細胞的增殖。此外，這種尺寸可控的載藥微球也可以注射的方式修復損傷組織，從而避免手術創傷。因此，這種治療方式可有效提高骨細胞的生物活性并刺激骨再生。
基于此，本實驗嘗試以麥冬甾體皂苷為模型藥物，以明膠為載體構建緩釋系統并研究其對小鼠成骨細胞的生物效應。
1材料與方法
本實驗以從麥冬提取物中分離得到的甾體皂苷類化合物(相對分子質量介于771-962Da)作為模型藥物，應用新型乳化-化學交聯技術，制備載藥明膠微球。微球在制備過程中，麥冬-明膠溶液與油相形成W/O型乳劑，再經EDC/NHS固化交聯處理形成微球。
具體過程如下:
(1)配制藥物-明膠溶液。將0.3g麥冬皂苷溶于100mL水中，超聲處理，配制成飽和溶液后，稱取明膠溶液，配制成適宜濃度的麥冬皂苷-明膠溶液。
(2)乳化。在三口瓶中加入250mL液體石蠟，然后加入3.1mLSpan80，攪拌使液體石蠟與Span80混勻。并在攪拌下緩慢滴加含藥明膠溶液，控制一定的攪拌速度，適時取樣，用顯微鏡進行觀察。水相與油相體積比控制為1∶5，石蠟與Span80的體積比控制為80∶1。并調控乳化時間為40min。
(3)交聯階段和后處理。當液滴完全分散均勻形成W/O型乳劑后，立即轉移至冰水浴中;待乳劑溫度降至5℃左右時，加入2.5mg/mL的EDC交聯固化40min，隨后加入異丙醇約50mL，繼續攪拌至有大量固體顆粒析出(約15min)，抽濾，用異丙醇洗滌3次，用石油醚洗滌3次，直至抽干，放在表面皿上，拿到真空干燥箱里真空干燥12h，即可得粉末狀麥冬-明膠微球。
2載藥明膠微球的性能檢測
2.1載藥明膠微球的微觀結構觀察及粒徑分析
利用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察載藥明膠微球的表面形態和微觀結構，并在光學顯微鏡下測量100個微球粒徑，繪制粒徑分布圖。
2.2載藥明膠微球的藥物釋放動力學和質量變化分析
采用紫外分光光度計檢測載藥微球在PBS中的釋放動力學，繪制體外藥物釋放曲線;并稱量釋藥前后微球的質量變化，繪制降解曲線。
2.3載藥明膠微球對細胞的生物效應檢測
用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養成骨細胞。成骨細胞足夠多時，加入0.25%的胰酶消化成骨細胞，1～2min后棄除胰酶，加入培養液中止消化，沖下貼壁的成骨細胞，吹打均勻制成細胞懸液，于紅細胞記數板上記數。根據細胞記數結果，將細胞懸液密度稀釋成1×104個/mL和2×104個/mL兩種，備用。之后，將20mg經γ射線消毒后的微球置于培養板中，用培養液浸泡24～48h。之后，除去培養板中培養液，加入配制好的細胞懸液，隔天換新的培養液。細胞與微球組裝一定時間后，采用四唑鹽(MTT法)比色法檢測細胞生長的情況，采用鐵氰化鉀法檢測細胞的堿性磷酸酶活性，并采用相差顯微鏡觀察細胞的礦化特征，評價明膠微球釋放的甾體皂苷藥物對成骨細胞的生理活性。
3載藥明膠微球的性能特征
3.1載藥明膠微球的微觀形貌及粒徑分析
圖1為包裹了麥冬甾體皂苷藥物和未載藥明膠微球的掃描電鏡形貌圖。從圖1可以看出未載藥的微球表面更光滑，而包裹了藥物的微球表面較粗糙。微球粒徑在1μm到9μm之間，粒徑分布如圖2所示，平均粒徑為(7.5±0.8)μm。
采用的雙乳化技術可以通過控制表面活性劑濃度和混合轉速來控制明膠微球的粒徑。但是，這種技術也存在局限性。在乳化過程中，有機介質對明膠的流體力學作用會破壞明膠的螺旋結構，并降低其力學強度，從而導致藥物從明膠基質中快速擴散出來。為了改善這種缺陷，本實驗對明膠微球進行了交聯處理。此外，通過交聯，也可以對明膠構建最佳密度的纖維網絡，這對于藥物的緩釋進而促進骨傳導具有極其重要的作用。
3.2載藥明膠微球的藥物緩釋特征
圖3為載藥微球溶液經高速離心后，紫外分光光度計進行吸光度測定所得曲線。藥物在波長274nm處的吸收峰為麥冬甾體皂苷的特征吸收峰，表明微球載藥成功。
本實驗研究了載藥明膠微球在PBS溶液中的藥物緩釋特征。圖4為明膠微球的藥物釋放特征和降解速率曲線。從圖4(a)可以看出，在起初的6d，藥物具有較快的釋放速率。隨后，釋放速率減慢并保持在相對平穩狀態。藥物在0～3、4～6、7～9、10～12d的釋放量分別是5.15、1.93、1.07、0.73μg/mL。
另外，從圖4也可以看出，明膠微球在PBS中的降解曲線與藥物釋放曲線的變化趨勢非常類似。表明在微球降解過程中，藥物釋放速率與明膠降解速率相一致。而且微球的藥物突釋現象并不太明顯，具有較好的釋放特征。事實上，甾體皂苷從微球中釋放既包含擴散機制，也有生物侵蝕的原因。明膠微球的釋放曲線主要取決于明膠的降解，而甾體皂苷的持續釋放可以被解釋為明膠的降解。明膠在PBS中可以快速降解，但是本實驗的交聯處理減緩了明膠的降解速率，并延長了藥物的釋放時間。
3.3載藥明膠微球對成骨細胞生理功能的調控作用
3.3.1載藥明膠微球對成骨細胞增殖率的調控作用
圖5顯示了成骨細胞MC3T3-E1分別與純明膠微球、載藥明膠微球復合培養時的增殖率。
從圖5可以看出，當與載藥明膠微球復合培養時，細胞增殖數量更多(P<0.05)。這表明藥物在成骨過程中具有重要作用，可很好地促進成骨細胞繁殖。
3.3.2載藥明膠微球對成骨細胞分泌ALP的調控作用
細胞與兩種微球復合培養7d后分泌的ALP水平如圖6所示。在本實驗中，細胞分別以兩種初始濃度(1×104個/mL和2×104個/mL)種殖在20mg的微球上。從圖6可以看出，在兩種濃度情況下，細胞與載藥微球復合培養時分泌的ALP水平更高。而且，細胞初始濃度越高，ALP增加的越多。這表明藥物能很好的激發細胞分泌成骨因子。
明膠微球釋放的甾體皂苷藥物及微球材料均對細胞的粘附、增殖及分泌具有重要作用。因此，這種復合微球可構建具有生理活性肽片段的親水表面，并以此作為細胞表面受體的配體。
3.3.3載藥明膠微球對成骨細胞礦化的調控作用
采用相差顯微鏡觀察細胞的礦化，進一步評價明膠微球釋放的甾體皂苷藥物的生理活性。從圖7(a)可以看出，細胞與載藥明膠微球復合培養10d后有尖棱狀礦化晶體形成。
作為對照同時研究了未載藥的明膠微球對細胞礦化的影響。從圖7(b)可以看出，這些微球與細胞聯合培養后，細胞未礦化形成晶體。由此也可以證實甾體皂苷藥物對細胞礦化的生理活性。
究其原因，可推測為甾體皂苷藥物對成骨細胞內的護骨素(osteoprotegerin，OPG)和核因子κB受體活化因子配體(receptoractivatorfornuclearfactor-κBligand，RANKL)mRNA表達具有影響�？赏ㄟ^顯著上調成骨細胞內OPG/RANKL比值來調節成骨細胞的生理活性。因此，這種具有骨誘導功能的載藥微球可被注射或移植到骨缺損處以刺激成骨細胞向骨組織分化，有效促進新骨形成。
4結論
1)選用麥冬的有效提取物甾體皂苷類化合物為模型藥物構建的載藥明膠微球可有效緩解藥物突釋現象并延長藥物釋放時間。
2)該載藥微球對成骨細胞生物學功能有干預作用，載藥微球釋放的藥物可有效提高成骨細胞的增殖率和分化水平，促其礦化形成晶體。
3)未來需進一步研究該載藥微球，揭示其在骨缺損修復中的生物效應和成骨機制。——論文作者：楊春蓉
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