發布時間：2020-12-30所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：實驗室條件下可培養的微生物約占自然界中微生物總數的1%，這限制了人們對99%未知微生物的認識和利用，而研究表明，那些不可培養的微生物是可以被開發和利用的，未能被純培養的微生物才是未知微生物的主體。微生物培養組學探索利用多種培養條件和長時間
摘要：實驗室條件下可培養的微生物約占自然界中微生物總數的1%，這限制了人們對99%未知微生物的認識和利用，而研究表明，那些“不可培養的微生物”是可以被開發和利用的，未能被純培養的微生物才是未知微生物的主體。微生物培養組學探索利用多種培養條件和長時間的培養，結合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法(MALDI-TOF-MS)和16S核糖體RNA(rRNA)測序可以大規模鑒定各種微生物，同時利用全基因組測序和宏基因組測序手段對未知微生物進行深入分析。本文綜述了國內外近年來微生物菌群培養組學在反芻動物胃腸道、禽類盲腸及家畜鼻腔微生物菌群研究中的最新進展，探討將動物體內菌群培養組學方法應用于動物疾病防治領域的可行性。作為一個新興的研究方法，盡管該培養組學還存在一些不夠成熟的方面，但它的發展前景十分廣闊，微生物菌群培養組學方法和其他研究方法的互補已經逐漸成為發展獸醫微生物學新的突破口。
關鍵詞：培養組學;MALDI-TOF-MS;16SrRNA;基因組測序;瘤胃微生物區系;盲腸微生物群;鼻腔微生物區系
動物體內和體表定植有大量微生物，這些共生微生物彼此之間、微生物與宿主之間通過相互的合作與競爭，形成了動態的、穩定的微生態平衡。在傳統研究中，人們主要是在純培養技術基礎上對微生物進行研究，然而自然環境中微生物種類復雜，純培養技術條件下可培養的種類僅占其1%，這極大地限制了人們在微生物多樣性研究中的進展[1]。相關研究表明那些未培養微生物是可以被開發和利用的，未被純培養的微生物才是微生物群體中的絕大多數[2]。近年來，傳統意義上的微生物學和現代信息技術形成交叉，使得人們可以從新的維度對微生物的特性與功能進行研究，其中，與動物樣本相關的腸道菌群基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，DNA)測序的通量和準確性的大幅提高，使得宏基因組測序等技術得以廣泛應用[2]。盡管這種基于DNA信息分析解讀的方法能幫助我們了解特定狀態的微生物組成，但仍然限制了以獲取活培養物為基礎的微生物制藥等相關行業的發展。因此微生物培養組學等基于活培養物分離、鑒定和開發的技術顯得尤為重要[4]。
近年來，培養組學的發展使得可培養的人體細菌庫劇增，人們對宿主-細菌之間相互作用關系的認知進一步加深。培養組學在動物醫學中的應用使可培養的細菌大量增加，在臨床致病菌分離鑒定中發現了新的分類群，且減少了在宏基因組學研究中的尚未明確分配的操作分類單元(operationaltaxo-nomicunits，OTUs)。本篇綜述在介紹培養組學研究方法的同時，重點介紹培養組學新技術在動物醫學領域的應用現狀，并展望其未來的發展趨勢。
1微生物菌群培養組學的發展與研究方法
培養技術是傳統微生物學研究的重要方法，但由于技術和條件的限制，絕大多數微生物無法在體外進行人工培養，難以分離到新的菌株，作為補充，宏基因組學在鑒定新微生物的過程中發揮了巨大作用。宏基因組學最早是由Handlesman提出的，是指特定環境下全部微生物基因組的總和。宏基因組學以環境樣本中的總DNA作為研究對象，通過構建宏基因組文庫，加以克隆、異源表達等步驟來篩選有用基因及其產物，繼而分析在復雜環境中的微生物多樣性及種群結構、代謝活動等，可用于鑒定新的生物活性物質、篩選醫藥、開發新型酶[1]。但是宏基因組學也存在許多局限，首先由于測序讀長較短，物種間的鑒別難度較大，使得菌種的精確分類變得困難;其次在宏基因組學分析中，分析工具亟待進一步優化以縮短工作時間，并應盡量減少存在于不同實驗室之間分類分配方面的異質性;此外，宏基因組學因其“深度偏差”(depthbiases)缺陷，對低密度菌群(≤105CFU·mL-1)并不敏感，難以體現低密度菌群的分類學特征[5]。相關研究表明，腸道菌群種類多樣性遠超于宏基因組學預測范圍[6]，且宏基因組學受多種變量干擾，不同的培養方式、DNA提取方法、信息分析軟件差異都會對測序結果產生影響[7];宏基因組學測序得到的DNA片段里也有相當一部分難以識別和歸類(即未分配OTUs)。綜合以上原因，基于傳統培養方法，結合高通量快速鑒定方法的培養組學(culturomics)逐漸建立。培養組學是一種利用多種條件對微生物進行純培養的方法，其通過模擬微生物生長的自然條件使微生物區系在體外得以重建，再利用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜法(MALDI-TOF-MS)和16S核糖體RNA(rRNA)測序對體外重建的細菌進行鑒定[8-9]。Lagier等[6]使用培養技術來證明使用培養組學在研究腸道微生物區系方面的效果不亞于焦磷酸測序。Angelakis等[10]通過一系列研究，認為通過結合宏基因組學與培養組學方法，可以比較完整地分類未知物種。事實上，初步研究發現，這兩種方法的檢測重復率為15%，以宏基因組學和培養組學方法研究屬和種水平上的微生物區系都能觀察到明顯的互補性[10]。關于宏基因組學和培養組學的優缺點比較見表1。
培養組學首先需要對樣本進行多重條件的培養，目的在于抑制多數有生長優勢的微生物，并促進低濃度微生物的生長，再利用適當的條件對特定的分類群進行培養，其顯著優勢是使用基于細菌表面蛋白分子量檢測的MALDI-TOF-MS技術對微生物進行高通量快速鑒定。如果質譜法未能鑒定成功，則需對樣本進行細菌核糖體(16SrRNA)基因序列分析，即分析比較細菌rRNA序列的相關性以確定細菌種系的發生關系，若測序結果與最新的參考菌株相似匹配度低于98.65%，該樣本分離株可能是一個新物種[11]。將得到的疑似新物種進行全基因組測序，最后，用分類基因組學描述或命名新分離的細菌，將從MALDI-TOF質譜和基因組測序得到的數據以統一格式上傳至相應數據庫，包括GenBank16SrRNA登錄號和菌株數等信息，以便于快速共享培養組學發現的新物種信息。培養組學的工作流程如圖1所示。
相關期刊推薦：《畜牧獸醫學報》本學報是中國畜牧獸醫學會主辦，創刊于1956年7月，刊登較高水平的學術論文和企業研究報告以及對生產實踐具指導性、啟發性的文章。主要欄目包括畜牧和獸醫兩大學科。
由于有不同的生長特性，一些對營養要求比較高的微生物只有在含稀有元素、特定的營養配比和適當的培養環境中才能被成功培養。培養組學首要的是提供多種培養條件，以篩選動物體內挑剔細菌的最佳生長條件。以專性厭氧菌為例，為滿足其生長條件，需要提供特定的設備和專門的試劑，包括含有多種補充劑(碳源、大量元素、金屬和一些生長因子)的復雜培養基。此外，為能在缺氧條件下培養細菌，已經設計出大量厭氧系統如厭氧罐、厭氧室和加斯帕系統等[12]。最后是選擇和鑒定由于低閾值濃度(少于105CFU·mL-1)而沒有被焦磷酸測序檢測到的少數細菌群體。通過向培養基中添加抗生素[13]和其他抑制劑[14]、主動或被動過濾細菌[15]、對糞便樣本進行熱休克[16]、加入噬菌體[17]等方法可以抑制培養基中生長旺盛的菌種。還可以通過使用血培養瓶[11]，添加糞便提取物[18]，添加抗壞血酸[11]、瘤胃液[19]、脂質[20]等來富集生長貧瘠的菌種。
2培養組學在反芻動物瘤胃微生物研究中的應用
反芻動物出生之際，其消化道中不含細菌等微生物。隨著不斷與外界環境接觸，其機體內微生物區系得以建立，且瘤胃環境內的微生物種類和數量最多，其中細菌占據主導地位，除此之外還有原蟲、厭氧真菌等[21]。反芻動物的消化主要依賴于瘤胃環境中的微生物群，其對反芻動物的生產性能具有重要的影響作用[22]。有研究表明，瘤胃內容物的細菌總密度為1010～1011CFU·g-1，其中纖毛蟲含量為104～106個·g-1，真菌密度為102～104CFU·g-1[22-23]。瘤胃微生物的組成結構、特定微生物組的質量和數量可以影響動物的能量吸收效率[24]，生產上可以通過改變日糧組分以改變瘤胃微生物組成來影響宿主動物，從而影響其生理功能[25]。微生物培養組學的誕生，極大地推進了反芻動物瘤胃微生物的研究進展，大量未知的瘤胃微生物可以通過已確定和未確定的厭氧培養基(含瘤胃液)進行培養，相關的基于微生物區系體外重建和高通量測序的研究也促進了反芻動物瘤胃微生物培養組學的發展。
2.1瘤胃微生物純培養技術
Hungate滾管技術以及手套厭氧培養箱已廣泛應用于厭氧微生物的分離培養[23]。由于不同的微生物對生長環境和特殊偏好營養物的需求各異，研究者可據此設計不同的培養方案對其進行篩選、分離、鑒定、純培養。培養和篩選過程中，可以通過調整生長環境參數(如培養基酸堿度、營養因子等)抑制雜菌生長，從而減少雜菌對目標微生物增殖的影響。主要的操作方法為在厭氧室內取部分瘤胃內容物樣品，厭氧環境：50mL·L-1H2、200mL·L-1CO2、750mL·L-1N2。采用0.22μm濾膜過濾后的1×厭氧磷酸鹽緩沖液，以10倍稀釋法將樣品從原液稀釋至10-6濃度。每塊培養基分別接種100μL不同濃度的樣品混合液，在厭氧室內39℃培養3d。作為空白對照，每種培養基類型取2個培養基，不進行接種，與其他培養基一起孵育。此外，取適量用于稀釋瘤胃樣品的緩沖液，接種至培養基作參照。上述培養結束后，取1mL無菌無氧的8.5g·L-1NaCl溶液均勻刮洗平板，用吸管收集該平板上所有的微生物，以備后續鑒定[26]。以現有的微生物培養方法為基礎，不斷地改進培養設備，綜合并優化各項培養條件/方式，可以更好地對目標微生物進行體外純培養。
2.2細菌鑒定技術研究
16SrRNA擴增和測序技術為描述新的細菌種類和分離培養細菌提供了便利，提高了細菌鑒定的效率[27]。rDNA分子測序分析技術是微生物群種屬研究上應用較成熟的方法。由于16SrRNA基因由9個高變區組成[10]，對細菌進行種屬鑒定時常選擇的鑒定區域為16SrDNA的V3、V4區[28]，在細菌的科、屬、種鑒定以及進化分析中常用的核糖體數據庫有Silva、Green-Gene和RibosomalDatabaseProject(RDP)等[29]。盡管原核生物16SrRNA基因序列分析技術廣泛應用于細菌菌種的分類鑒定，但是其經濟成本和時間成本較高，限制了該技術在培養組學中的應用。2009年，首次有報道稱MAL-DI-TOF-MS作為一種新的病原微生物快速診斷方法，可滿足臨床上對微生物“屬”和“種”的兩級精確鑒定的需要[30]，該方法具有快速、工作程序簡單、靈敏度高、分辨率高的優點，通過檢索特征性質質譜峰數據庫或與已知微生物的質譜峰比較可以實現對微生物的快速鑒定[31]。MALDI-TOF-MS在培養組學中的創新應用使廣大研究者探索復雜的菌群環境成為可能。
2.3培養基類型、樣品稀釋度和系統發育與瘤胃微生物可培性的關系
目前，反芻動物瘤胃微生物培養組學中亟待解決的難題是有關影響培養因素的研究，以及如何增強未知微生物可培育性。2018年，Zehavi等[26]研究顯示，多因素性狀決定了瘤胃微生物的可培育性。培養基類型、樣品稀釋度均會影響瘤胃微生物在凝膠平板上的豐度，且后者的影響作用更甚。另外，瘤胃環境中OTUs豐度與可培養性呈正相關。瘤胃的復雜性和功能譜系超出了當前人們預期，但是其中一部分稀有的微生物中可以在純培養中進行研究，這使人們得以更深入地了解瘤胃生態系統及其功能。
反芻動物瘤胃微生物群的培養是瘤胃微生物培養組學研究的重要內容之一。隨著瘤胃微生態系統研究技術的進一步發展，反芻動物消化系統微生物功能得以深入研究。計算機科學與自然生命科學的交叉融合，使得組學技術在詮釋瘤胃微生物的組成功能及代謝特征中作用凸顯，尤其是在瘤胃微生物資源研究中，培養組學的重要性不言而喻。在瘤胃微生物培養組學研究中找出該系統生境中可被培養的部分以及各種影響其可培性的因素十分重要。采集樣品的稀釋度與實驗過程中使用的各種類型的培養基都會影響瘤胃微生物的可培性，說明在體外重建瘤胃微生物系統仍需要大量細致的培養條件試驗和探索。研究人員通過培養組學發現瘤胃微生物的復雜性及其功能譜系遠超預期。因此，通過對瘤胃微生物區系進行體外重建，以深入了解其生態/生物功能，對開發應用瘤胃微生物資源具有重要意義。——論文作者：彭娜，彭先啟，樂敏
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