禽流感病毒H7亞型競爭ELISA抗體檢測方法的建立

發布時間：2019-12-18所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次

摘 要： 摘要 將禽流感病毒 H7 亞型標準抗原作為免疫原免疫 BALB/c 小鼠，取免疫合格的脾細胞與骨髓瘤細胞(SP2/0)進行融合。通過血凝抑制試驗，篩選得到 12 株雜交瘤細胞上清具有 HI 效價，且與禽流感病毒 H7 亞型陽性血清間具有較好的競爭效果。將競爭效果最好的 1H

　　摘要 將禽流感病毒 H7 亞型標準抗原作為免疫原免疫 BALB/c 小鼠，取免疫合格的脾細胞與骨髓瘤細胞(SP2/0)進行融合。通過血凝抑制試驗，篩選得到 12 株雜交瘤細胞上清具有 HI 效價，且與禽流感病毒 H7 亞型陽性血清間具有較好的競爭效果。將競爭效果最好的 1H11 細胞擴大培養后制備腹水，獲得的單克隆抗體具有效價高、特異性好等特點。使用 H7 標準抗原包被 ELISA 板，將 HRP 標記的單克隆抗體作為競爭抗體，建立了一種禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測方法。利用該方法對待檢血清進行測試，與 HI 試驗有 99.3%的符合率，說明試制的禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測試劑盒可以用來檢測禽流感病毒 H7 亞型抗體，且操作簡便快捷，可批量操作，大樣本檢測雞群抗體水平。

　　關鍵詞 禽流感病毒 H7 亞型;單克隆抗體;競爭 ELISA;抗體檢測

　　禽流感是由禽 流感病毒 (Avian Influenza Virus，AIV)引起的一種急性呼吸道傳染病，具有傳染性強、傳播速度快、抗原易變異等特點[1]。自 2013 年春天在長三角地區出現新型 H7N9 病毒疫情以來，冬春季節交替時人感染 H7N9 病毒的病例每年都有發生[2- 3]。該病毒在我國活禽交易市場及養禽農場的感染范圍不斷擴大，2017 年 3- 6 月，在湖南、河北、河南、天津、山西、黑龍江和內蒙古等省份均有家禽感染高致病性 H7N9 病毒的報道。自疫情暴發以來，約 6 萬羽家禽感染，30 萬羽家禽遭撲殺。多家獸醫機構監測結果均表明，我國 H7N9 亞型流感病毒的養殖場陽性率和個體陽性率在總體上均呈現逐年上升趨勢，對家禽養殖業和公共衛生安全造成了嚴重威脅[4- 5]。國家禽流感參考實驗室采用反向遺傳技術，研制出重組禽流感病毒(H5+H7)二價滅活疫苗(H5N1 Re- 8 株 +H7N9 H7- Re- 1 株)，通過深入調查研究和專家論證，農業部決定先行在廣東省和廣西壯族自治區對該疫苗進行試點性應用，再進一步在全國范圍內進行推廣，為有效控制 H7N9 病毒的蔓延奠定了基礎。常規檢測禽流感病毒抗體的方法是血凝抑制(HI)試驗，HI 試驗對操作人員的專業素質要求較高，過程繁瑣，對結果判定也有較強的主觀性。因此，研制一種禽流感 H7 亞型抗體檢測方法對評價疫苗免疫效果和及時監測雞群抗體水平顯得極為重要。

　　1 材料與方法

　　1.1 細胞與試驗動物

　　多發性骨髓瘤細胞(SP2/0)來源于農業微生物學國家重點實驗室，由武漢科前生物股份有限公司保存備用，BALB/c 小鼠購于湖北省實驗動物研究中心。

　　1.2 主要試劑與試劑盒

　　RPMI- 1640 購 自 HyClone，50% PEG1450 (P7181)、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠 IgG、50× HAT(A：氨基蝶呤)、100×HT(H：次黃嘌呤和 T：胸腺嘧啶核苷)、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、鼠類單克隆抗體亞類鑒定試劑盒購自 Sigma 公司，青鏈霉素(100×)、胎牛血清購自 Gibco 公司。禽流感病毒 H7 亞型血凝抑制試驗抗原，加入 2 mL pH 值 7.4 的 PBS 溶解作為免疫原。

　　1.3 禽流感病毒 H7 亞型單克隆抗體的制備

　　1)按照常規方法進行動物免疫。三免后 14 d，尾靜脈采血，間接 ELISA 測定血清效價。選擇效價最高的小鼠進行加強免疫。免疫后第 3 天，進行細胞融合。

　　2)按照常規方法進行細胞融合。采用間接 ELISA 對雜交瘤細胞上清進行篩選。陽性孔再經過 3 次有限稀釋法進行亞克隆，待陽性率達到 100%時擴大培養，用于制備腹水，并保存于液氮。參照文獻進行腹水的制備，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，離心取上清[6]。

　　1.4 禽流感病毒 H7 亞型抗體競爭 ELISA 檢測方法的建立

　　1)競爭 ELISA 抗體檢測方法的初步建立。將獲得的具有競爭效果的單抗純化酶標后，初步建立競爭 ELISA 抗體檢測方法。

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　　2)特異性試驗。用試制試劑盒分別對 5 份禽流感病毒 H7 亞型抗體陰性血清、禽流感病毒 H5 亞型(AIV- H5) 陽 性 血 清 、 禽 流 感 病 毒 H9 亞 型(AIV- H9)陽性血清、新城疫病毒(NDV)陽性血清、傳染性支氣管炎病毒(IBV)陽性血清、傳染性法氏囊病毒(IBDV)陽性血清進行檢測，根據檢測結果評價其特異性。

　　3)敏感性試驗。選取 6 份陽性血清和陽性參考血清從 2 倍開始倍比稀釋至 64 倍，分別用 3 批禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測試劑盒和 HI 試驗 2 種方法檢測。當待檢血清的 HI 抗體效價稀釋至 4log2 時 (HI 試驗判定標準：當 HI 抗體效價≥4log2，判為陽性;HI 抗體效價<4log2，判為陰性)，對應試制試劑盒檢測的 PI 值應≥40%，以此來評價試制試劑盒的敏感性。

　　4)與 HI 試驗符合率比較試驗。與 HI 試驗同時檢測 150 份樣品，比較 2 種方法檢測結果的符合率。

　　2 結果與分析

　　2.1 單克隆抗體的篩選

　　對陽性雜交瘤細胞株所分泌的上清做競爭效果的篩選，其中陽性血清的 OD450 nm 值用“P”表示，陰性血清細胞上清的 OD450 nm 值用“N”表示，當 N/P 值越大時，細胞上清的競爭效果越好。試驗結果表明，1H11 細胞株所對應的抗體 N/P 值最大，競爭效果最佳(表 1)。

　　2.2 競爭 ELISA 抗體檢測方法的初步建立

　　使用方陣滴定試驗摸索包被抗原和酶標抗體的稀釋滴度。將抗原按 1∶400、1∶800、1∶1 000、1∶ 1 200、1∶1 500、1∶2 000、1∶2 500、1∶3 000 進行稀釋，分別加入到酶標板的第 1~8 行，每個稀釋度加 1 行，每孔 100 μL。將酶標記抗體按 1∶400、1∶ 600、1∶800、1∶1 000、1∶1 200、1∶1 500 進行稀釋，分別加入酶標板的第 1~6 列 /7~12 列，每個稀釋度加 1 列，每列 100 μL。按照競爭 ELISA 的常規步驟進行操作[7]，方陣滴定結果見表 2。當抗原 1∶1 000 稀釋、酶標記物 1∶1 000 稀釋時，陽性對照 PI 值最大，因此，選擇抗原最佳包被濃度為 1∶1 000 稀釋(每孔抗原包被量含量為 2 μg/mL)、酶標記物最佳稀釋倍數為 1∶1 000，其 N/P 值最大(表 3)。

　　2.3 特異性試驗

　　用試制的禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測試劑盒檢測 5 份禽流感病毒 H7 亞型抗體陰性血清，結果均為陰性(表 4);檢測常見禽病的陽性血清，檢測結果均為陰性(表 5)，說明該試劑盒與其他常見禽病的陽性血清均無血清學交叉反應。以上結果表明，試制的禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測試劑盒具有良好的特異性，可用于血清中禽流感病毒 H7 亞型抗體檢測。

　　2.4 敏感性試驗

　　用試制的 3 批禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測試劑盒和 HI 試驗 2 種方法檢測 7 份血清。將陽性血清 6 份和陽性參考血清從 2 倍開始倍比稀釋至 64 倍，用 HI 試驗和試制的試劑盒 2 種方法分別檢測血清效價，結果基本一致。說明試制的禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測試劑盒具有良好的敏感性，可以用來檢測禽流感病毒 H7 亞型抗體(表 6)。

　　2.5 與 HI 試驗符合率比較試驗

　　將試制的禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測試劑盒與 HI 試驗同時檢測雞血清 150 份，禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測試劑盒檢測為陽性 28 份，陰性 122 份，HI 試驗檢測為陽性 27 份，陰性 123 份。試制的試劑盒與血凝抑制試驗相比，符合率為 99.3%(表 7)。試制的試劑盒與血凝抑制試驗的符合率較高，由此也證實了所研制的試劑盒在檢測雞血清中禽流感病毒 H7 亞型抗體的可靠性。

　　3 討 論

　　目前，關于 H7 亞型禽流感病毒單克隆抗體的應用相繼有報道，主要是在膠體金試紙條、間接免疫熒光、免疫組化等方面的應用[8- 9]。在本研究中，制備了 12 株特異性針對 H7 亞型禽流感病毒的單克隆抗體，并通過競爭 ELISA 方法篩選 1 株具有較好血凝抑制作用的 1H11 細胞株，制備并純化得到單克隆抗體，建立了 1 種應用于評價抗 H7 亞型禽流感病毒血清抗體水平的競爭 ELISA 抗體檢測方法，試制了試劑盒。用試制的禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測試劑盒檢測 150 份血清樣品，并且與 HI 試驗進行比較，符合率為 99.3%;選取 6 份禽流感病毒 H7 亞型 HI 抗體效價≥9log2 和陽性參考血清同時進行敏感性檢測，結果表明試制試劑盒與 HI 試驗敏感性一致;檢測禽流感病毒 H5 亞型(AIV- H5)、禽流感病毒 H9 亞型(AIV- H9)、新城疫病毒(NDV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)陽性血清均為陰性，檢測已知無禽流感病毒 H7 亞型感染的血清全部為陰性，證明試劑盒特異性良好。

　　該方法操作簡便快捷，可批量操作，大樣本檢測雞群抗體水平，為 H7 禽流感病毒的免疫水平監測提供依據。在我國，高致病性禽流感病毒的免疫防控策略是通過滅活疫苗的免疫維持雞群中高抗體水平，雞群中抗體水平的檢測主要依賴于血凝抑制試驗，對試驗者專業要求高，且工作量大，不利于大規模開展抗體監測。競爭 ELISA 抗體檢測方法的使用可很好地替代血凝抑制試驗，操作簡便快捷，適用于大規模進行田間檢測 H7 亞型禽流感病毒的抗體水平，對雞群及時、精準的免疫提供指導意義。