發布時間：2019-12-09所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:微針是一種高效、安全的新型經皮藥物遞送技術，具有其他傳統經皮給藥技術不具備的優勢，而其皮膚穿刺性能是該技術能遞送藥物的前提和關鍵。筆者綜述了目前現有穿刺性能的評價方法，從微針自身的機械強度以及皮膚穿刺效果出發，分別描述了斷裂力測定、壓
摘要:微針是一種高效、安全的新型經皮藥物遞送技術，具有其他傳統經皮給藥技術不具備的優勢，而其皮膚穿刺性能是該技術能遞送藥物的前提和關鍵。筆者綜述了目前現有穿刺性能的評價方法，從微針自身的機械強度以及皮膚穿刺效果出發，分別描述了斷裂力測定、壓變性能測試、有機染料染色法、表皮水分流失法、電阻抗法、組織學切片、共聚焦顯微鏡法以及光學相干斷層掃描法等的應用，并且介紹了各種方法的適用范圍與優缺點，為其他研究者在微針穿刺性能評價方法的選擇上提供參考及借鑒。
關鍵詞:微針;穿刺性能;機械強度;評價方法
微針是指包含多個微型針頭的陣列，針的長度一般為幾十微米至幾毫米，而其尖端直徑為幾十微米以下[1]。微針是一種高效、安全、新型的經皮給藥技術，擁有其他傳統經皮給藥技術無法達到的優勢[2]。第一，微針打破了經皮給藥中的重大屏障———角質層對藥物的阻滯，不僅使藥物的遞送效率大大提升，還使得大分子藥物和親水性藥物的經皮遞送成為可能。劉姝等[3]制備了胰島素透明質酸微針，并以人離體皮膚模型考察了微針的體外透皮性能，發現與同劑量藥物溶液相比，微針對胰島素的體外經皮吸收有顯著的促進作用。第二，由于其微小的結構特點，微針在應用過程中可以突破角質層障礙而不觸及真皮內的神經組織，實現無痛微創給藥，提高了患者順應性[4-5]。目前，已有許多學者研究過不同材料制備的微針，如玻璃、糖、金屬、硅、聚合物、水凝膠等;也有許多不同類型的微針，如中空微針、固體實心微針、可溶性微針和溶脹微針等，并已應用于局部麻醉[6]、免疫接種[7]、微量取樣[8]、DNA給藥[9]、皮膚美容[10]、蛋白質和多肽類藥物遞送[11]等方面。然而，目前微針產品商業化仍較少，究其原因很多，比如微針刺入過程中存在較多的力學問題，影響其穿刺有效性;微針使用過程中存在的安全性問題，如微針斷裂造成有害殘留等;較其他劑型而言，微針的載藥量較小;微針的微創給藥對皮膚造成的影響等。
其中，微針的穿刺性能是微針能否成功應用的決定性因素，也是限制微針發展與推廣的一個關鍵，尤其是對由聚合物材料制備的可溶性微針來說至關重要。在穿刺過程中，由于皮膚的不均勻性、刺入過程中不可避免的移動等原因，微針會受到各種各樣的力，而當外界的力達到一定程度時，會使微針發生斷裂、彎曲等形變，影響微針的穿刺性能。因此，微針需要有一定的機械強度去克服這些因素可能帶來的失敗，且不同的穿刺方式、生物因素等都會影響微針的穿刺性能。目前還沒有一種單獨的體外方法能非常好地模擬微針在體內的穿刺過程，表征微針的機械性能和力學行為。筆者綜述了目前現有的穿刺性能的評價方法，并且對其適用范圍與優缺點進行了比較，為研究者們在微針穿刺性能評價方法的選擇上提供一定的參考及借鑒。
1微針機械性能測定
1.1微針斷裂力的測定
最初，Zahn等[12]將單根空心的多晶硅微針裝載到玻璃片上，用夾子固定后，使用測力計對微針的尖端施加一個持續增大的力，直至微針斷裂，微針斷裂時測力計上顯示的力即為微針的斷裂力。微針技術發展至今，微針斷裂力的測定方法也有了較大的發展。
由于微針在給藥時，垂直皮膚進針，故軸向力機械性能測試是微針斷裂力測定中常用的方法。該方法使用位移-力測試站對斷裂力進行精確測定，一般對微針施加一個垂直于基底面的力，繪制力-位移的曲線，由此測定微針的斷裂力[13-15]。Lee等[15]使用位移-力測試站對其制備的3×3微針陣列進行斷裂力的測定:先將微針裝備到移動傳感器的表面，施加一個垂直于微針基底的軸向力，使傳感器表面以恒定的速度(1.1mm·s-1)向一塊堅硬的不銹鋼平板表面移動，測試站記錄移動過程中的力與位移，見圖1。力-位移曲線通常反映了微針斷裂時力的突降，發生突降瞬間的力即可認為是微針的斷裂力，通過分析該曲線可以得到微針的斷裂力，見圖2。
除了軸向機械性能外，不規則的皮膚表面往往會導致微針刺入的不完全，從而引起微針的彎曲，特別是聚合物微針。因此，為較好地確保微針的刺入，考察微針的橫向斷裂力同樣很有必要的。一般采用機械性能測試站進行試驗，對微針使用一個橫向力(垂直于微針且平行于基底面)直至微針斷裂，過程中探頭記錄位移與力[13-14]。分析力-位移曲線，得到微針的橫向斷裂力(該橫向斷裂力是針對一整排微針而不是單根微針)。
由力-位移曲線，可以測得微針的理論斷裂力，與皮膚所需的刺入力進行比較，從而判斷微針是否可以刺入皮膚。當微針的斷裂力小于皮膚穿刺力時，微針則會在刺入皮膚之前斷裂，無法刺破皮膚。因此，研究者們[16-19]應進行皮膚穿刺力測定，并將其與微針的斷裂力進行比較，從而預測微針的穿刺有效性。
1.2微針壓變性能
上述微針的斷裂力測定適用于脆性材料，采用相對韌性材料制備的微針在探頭下壓的過程中力-位移曲線不存在突降，表明微針只發生了形變而沒有斷裂。有研究者采用在微針上施加力，然后利用顯微鏡觀察受壓后微針的形變狀況來直觀反映微針的機械性能。將微針裝在物性分析儀上，探頭恒速向下移動對微針施加壓力，當壓力到達一個設定值后探頭上移，顯微鏡下觀察并測定施壓前后微針高度的變化，以此反映微針的機械性能[20-22]。Donnelly等[23]使用物性分析儀對其制備的水凝膠型微針進行壓變性能的考察，發現當施加的壓力為0.36N·針-1時，微針針尖被明顯壓縮變鈍，壓力上升至0.71N·針-1時，微針開始變彎。
除了上述通過物性分析儀設定壓力值，用顯微鏡觀察微針的形變方法外，也有研究者將位移值作為參數，進行壓變性能的表征。Zhu等[24]研究了韌性微針的壓變性能，采用物性分析儀通過在設定相同位移值前提下，分析力-位移曲線的縱坐標來評判微針的機械性能，應力越大表明微針的機械強度越大。
2微針皮膚穿刺實驗
雖然測定微針的斷裂力和壓變性能可在不使用離體皮膚的情況下模擬微針的理論穿刺過程，預測微針的穿刺有效性，但由于微針使用過程對穿刺的影響、皮膚與不銹鋼板等平面存在較大差異等原因，微針實際的刺入效果是無法通過斷裂力或壓變性能準確預測的。因此，多數研究采用生物組織(通常是離體人皮膚或動物皮膚)來考察微針真實的穿刺性能。在這些研究中常使用以下方法來評價微針的穿刺有效性。
2.1有機染料染色
有機染料已經被廣泛用于微針穿刺有效性的研究。這些染料可以選擇性地對活性表皮的細胞進行染色，由于大部分使用的有機染料為水溶性的，所以這些染料不會染色皮膚的角質層部分，但可以標識出微針在皮膚上創造的微孔通道(水性環境)，是一種可以快速判斷微針穿刺有效性的評價方法。目前微針研究常用的水溶性染色劑為亞甲基藍、臺盼藍及羅丹明B[9，25-28]。Pearton等[9]使用亞甲基藍溶液對微針穿刺后的離體人皮膚進行染色后觀察發現，隨著微針施加力度的增加，孔洞效果越明顯，見圖3。
也有其他研究者采用將染色劑直接載入微針從而染色微孔通道的方法，相比上述微針穿刺后的染色方法更加可控，染色效果更為顯著。Chen等[29]將0.1%臺盼藍染料載入干擾素α2b可溶性微針中，刺入離體豬皮膚，通過觀察皮膚藍點數來反映微針是否刺入皮膚。另外，Kennedy等[30]將羅丹明B熒光染料直接載入可溶性微針中，將微針刺入小鼠耳背皮膚后通過熒光體內成像系統來反映微針是否能刺入皮膚及藥物進入體內后的分布情況。
2.2表皮水分流失法
表皮水分流失法(transepidermalwaterloss，TEWL)是一種非侵入性的監測方法，能夠靈敏、實時地提供皮膚表面的水分流失信息。TEWL雖然不能測定微針的刺入深度，但可以間接測定微針對皮膚的穿刺效果。研究表明[25-26，31]，微針刺入皮膚會造成皮膚角質層屏障的破壞，從而引起皮膚表面水分流失的增加。而當由微針產生的微孔通道關閉時，皮膚屏障功能恢復，皮膚表皮水分流失會恢復到正常值。因此TEWL法不僅可用于微針穿刺性能的研究，還可用于微針使用后皮膚屏障恢復等微針安全性的研究。Yan等[31]研究發現，當微針刺入后，TEWL值呈10～25倍快速增長，但隨著時間的推移數值回到基線值，表明皮膚屏障功能的恢復。Kusamori等[32]同樣發現微針刺入前后TEWL值會先劇烈增加，隨后慢慢恢復至原來的水平，并與多次膠帶剝離引起的角質層破壞現象進行比較，發現膠帶組的TEWL值難以恢復至原來的水平。
然而，TEWL法確定微針刺入效果的準確性尚存在爭議。Gomaa等[26]觀察到微針刺入1h后，TEWL值與臺盼藍染色的微孔數量之間存在近似相關，他們推斷TEWL值與微針所刺破的微孔通道數近似成正比關系。然而Chilcott等[33]的研究表明，TEWL不能用于預測藥物的經皮遞送。TEWL值可能受多種因素的影響，如不同皮膚間的差異、實驗條件、大氣溫度、測定儀器等，這使得不同研究者的數據以及結論存在不一致性。
2.3電阻抗法
電阻抗法同樣也是驗證微針刺入皮膚的方法，被研究者廣泛采用[16，19，34-36]。皮膚的電阻抗值主要取決于角質層，角質層相當于一層很薄的絕緣膜，當微針刺破皮膚角質層后電阻抗值發生改變。目前已經證實皮膚滲透性和皮膚電阻抗之間存在強烈的負相關性[35，37]，因此可以將電阻抗值作為衡量皮膚屏障功能的有效指標。Davis等[16]通過電阻抗法來驗證微針是否成功刺入皮膚，采用3名成年男性作為受試者，當針刺入受試者皮膚時，針-皮膚回路的電阻迅速下降，使用該方法測得微針尖端半徑在30～80μm所需的皮膚刺入力在0.08～3.04N，并且比較了壓變法與電阻抗法的測試效果，表明電阻抗法檢測更加靈敏、現象更加顯著。圖3微針使用不同給藥力量刺入人皮膚后的亞甲基藍染色圖此外，也有研究者將電阻抗法用于評估微針使用的安全性。Kelchen等[38]利用電阻抗法研究老年人使用微針后微孔通道的關閉動力學，施加不同長度、數量的微針后在未知微孔通道是否處于封閉條件進行皮膚電阻抗測定，結果表明，老年人皮膚的微孔關閉較年輕人慢。
2.4組織學切片
組織學切片也是證明微針穿刺有效性的一種方法，可以在視覺上直觀地反映出微針是否刺入皮膚以及刺入的位置，但該方法較為復雜。先將微針處理后的皮膚從大塊皮膚中切除下來，在合適的溶媒中固定，然后立即放入液氮中冷凍。將樣品切成6～12μm厚的石蠟切片，將切片用蘇木精和伊紅染色后觀察微針刺入形成的微孔通道[18-19，39-41]，組織切片效果見圖4。Leeladurga等[41]將制得的微針用恒定的拇指壓力施加于豬耳皮膚后，通過組織學切片觀察發現長度為0.6，1.2，1.5mm的微針均能有效刺入皮膚，且結合顯微鏡觀察與軟件處理，它們的刺入深度分別為363.25，521.16和642.34μm。
該法雖然可以讓研究者直接觀察到微針是否刺入皮膚并測量微針的刺入深度，但其屬于破壞性方法，存在一定的局限性。Park等[42]制備了羧甲基纖維素微針，將其刺入豬皮膚后通過組織學切片染色觀察發現:經過微針處理后，豬皮膚發生變形，產生約200μm深的微孔通道。該法存在的缺陷是:皮膚樣品會在活體切割以及切片過程中受到機械性傷害以及拉力、壓力等，容易改變皮膚的原本狀態以及微針的刺入形態;在皮膚樣品的固定和染色時，染色劑會對皮膚造成刺激，使皮膚收縮、微孔變形。Coulman等[43-44]使用同種硅微針處理皮膚后，通過比較組織學切片染色的圖像與光學相干斷層掃描圖像，分析發現組織學切片組的微孔大于OCT組，表明組織學切片法會使微孔變大。
2.5共聚焦顯微鏡
共聚焦顯微鏡法多被用于測定微針在皮膚上制造的微孔通道尺寸。隨著微針在皮膚上的刺入和移除，皮膚樣品用含熒光物質的溶液處理后，采用激光共聚焦顯微鏡觀察，共聚焦顯微鏡能檢測這些熒光物質并測出微孔的深度[25，45-46]。此外，也可將熒光物質作為模型藥物直接載入微針中，刺入皮膚后用共聚焦顯微鏡觀察。例如，有研究者[47]利用共聚焦顯微鏡研究微針中藥物的擴散情況。
該法是一種非侵入性的方法，不僅能用于體外也能用于體內研究，可以避免組織學切片的復雜操作過程。其主要的缺點為該技術的穿透和可視化深度在200～250μm，限制了其在測定由較長微針產生的位于較深皮膚層的微孔通道尺寸方面的應用。
2.6光學相干斷層掃描
光學相干斷層掃描(opticalcoherencetomography，OCT)是近十年迅速發展起來的一種成像技術，它利用弱相干光干涉的基本原理，檢測生物組織不同深度層面對入射弱相干光的反射和散射信號，得到生物組織二維或三維結構圖像。OCT被認為是唯一一種能提供角質層、活性表皮層和上真皮層的橫向成像技術[48]。此外，OCT的穿透和可視化深度為2000μm，遠遠大于上述提到的共聚焦顯微鏡，是一種非侵入性的、實時檢測微針皮膚穿刺效果的技術，被認為是目前檢測微針刺入皮膚效果眾多方法中較好的選擇[40]。
較多的研究者[14，23，43，49]采用OCT法測定微針刺入皮膚的效果和深度，并實時檢測皮膚中微針和微孔的情況，以得到更多的研究信息，包括微針的刺入深度以及微孔直徑等。Lee等[47]制備了明膠和羧甲基纖維素為基質材料的微針，并將其刺入豬皮膚，利用OCT測定微針的刺入效果，OCT的2D橫向圖表明微針的刺入深度大約為250～300μm，縱向圖表明微孔的直徑大約為200μm，3D模型圖表明微針刺入了皮膚，并在角質層上產生了微孔通道。
3結語
微針是一種能高效安全經皮遞送藥物的新技術，而有效穿刺皮膚是其發揮作用的前提，尤其是機械性能相對較差的可溶性微針，因此在微針的評價中，能快速準確檢測其穿刺有效性及穿刺效果顯得十分重要。微針的皮膚穿刺與許多因素有關，如微針的機械性能(如制備材料、幾何形狀、長度、密度等)、所加載的藥物、給藥方式和穿刺用的皮膚等。其中，微針的機械性能是影響微針穿刺性能的一個重要因素，然而，微針機械性能并不能完全模擬和預測微針的穿刺性能，因此需要結合能夠直接觀察微針是否刺入皮膚的方法和技術。
筆者綜述了目前微針研究中常用的測定微針機械性能和皮膚穿刺性能的方法。然而每種方法都有其適用范圍和應用限制，還沒有一種方法能夠很好地模擬和完全反映微針在實際應用中的穿刺性能。微針的斷裂力和壓變性能在不使用離體皮膚的情況下從理論上判斷微針的穿刺有效性;微針刺入皮膚后的有機染色法、電阻抗法和表皮水分流失法是可以判斷微針是否成功刺入的快速定性方法;組織學切片、共聚焦顯微鏡和光學相干斷層掃描法可以分析微針刺入皮膚后的微孔參數。所以可以同時選擇幾種不同的方法對微針穿刺性能進行較為全面的評價。相信隨著微針研究領域的不斷發展，未來將會有更多新的技術和評價方法應運而生。
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