發布時間：2019-12-09所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：目的 改進高效液相色譜方法測定硫酸奈替米星注射液含量。方法 色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱 (4.6mm250mm, 5m);流動相為庚烷磺酸鈉緩沖液(0.6%庚烷磺酸鈉溶解于0.1mol/L的磷酸二氫鉀溶液中，磷酸調pH至2.5)-乙腈(77:23, V/V);檢測波長205nm;流速1.0m
摘要：目的 改進高效液相色譜方法測定硫酸奈替米星注射液含量。方法 色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱 (4.6mm×250mm, 5μm);流動相為庚烷磺酸鈉緩沖液(0.6%庚烷磺酸鈉溶解于0.1mol/L的磷酸二氫鉀溶液中，磷酸調pH至2.5)-乙腈(77:23, V/V);檢測波長205nm;流速1.0mL/min;柱溫35℃;進樣量20μL。結果 硫酸奈替米星濃度在0.1~1.0mg/mL范圍內與峰面積的線性關系良好，相關系數r為1.0000;平均回收率為98.3%，RSD為0.5%(n=9)。改進方法與微生物檢定法所測結果無顯著性差異。結論 該方法操作簡便快捷、專屬性強、線性范圍寬，精密度和準確度高，重復性好，該方法可等效替代抗生素微生物檢定法用于硫酸奈替米星注射液的含量測定。
關鍵詞：硫酸奈替米星;高效液相色譜;抗生素微生物檢定;等效替代
奈替米星是以西索米星為起始原料的半合成氨基糖苷類抗生素，系廣譜殺菌抗生素，其生物利用度高，毒性較同類抗生素小，耐受性好，臨床療效高，在細菌感染方面具有較好的治療作用[1-2]。目前中國藥典、歐洲藥典及日本藥局方均采用抗生素微生物檢定法測定硫酸奈替米星及相關制劑的含量。該方法雖然能直觀反映含量與抗菌能力的關系，因為存在操作費時、專屬性差、對操作人員要求高且易產生諸多操作誤差等缺點，所以高效液相色譜法已成為抗生素含量測定的主流[3]。美國藥典收載方法為高效液相色譜法，其流動相中含有高濃度離子對試劑，存在色譜系統平衡慢、檢驗成本高、對色譜柱傷害嚴重且分離能力差等問題[4-5]。為有效解決上述問題，本文對高效液相色譜條件進行了改進，使用低濃度的離子對試劑即能達到有效分離，方法準確、簡便易行。
1 儀器與試劑
1.1 儀器
Shimadzu高效液相色譜儀(LC-20AB泵、DGU- 20A3R在線脫氣機，SIL-20ACHT自動進樣器，CTO- 20AC柱溫箱，SPD-M20A紫外檢測器)，Mettler Toledo XS205電子天平，色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(4.6mm×250mm, 5μm)，Millipore去離子水發生裝置。
1.2 試藥
奈替米星標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號：130355-200702，577U/mg)，西索米星對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：130635- 201301，56.0%)，奈替米星對照品(USP對照品，批號：1460500，110℃減壓干燥至少3h，以干燥品計為65.5%)，乙腈為色譜級(默克股份兩合公司)，庚烷磺酸鈉(日本東京化成工業株式會社)，硫酸奈替米星注射液[64批次，規格為1mL:5萬單位(相當于50mg) 和2mL:10萬單位(相當于100mg)]分別由國內A、B、 C、D、E、F、G、H、I和J廠家提供，硫酸奈替米星原料(批號：01-05013-151103)由國內K廠家提供。
2 含量測定方法的建立
2.1 色譜條件
色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(4.6mm×250mm, 5μm);流動相：庚烷磺酸鈉緩沖液(0.6%庚烷磺酸鈉溶解于0.1mol/L的磷酸二氫鉀溶液中，磷酸調 pH至2.5)-乙腈(77:23, V/V);檢測波長：205nm;流速：1.0mL/min;柱溫：35℃;進樣量為20μL。系統適用性溶液色譜圖中西索米星峰與奈替米星峰間分離度不低于3.0，奈替米星峰與其相對保留時間1.1倍雜質峰的分離度應符合要求，連續進樣6針，奈替米星峰面積的RSD不大于1.0%。
2.2 溶液的配制
流動相：庚烷磺酸鈉緩沖液(0.6%庚烷磺酸鈉溶解于0.1mol/L的磷酸二氫鉀溶液中，磷酸調pH至 2.5)-乙腈(77:23, V/V)。系統適用性溶液：取奈替米星標準品和西索米星對照品各約22mg，精密稱定，置于50mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。
標準品溶液：取奈替米星標準品約22mg，精密稱定，置于50mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。
供試品溶液：取硫酸奈替米星注射液1.00mL至 50mL容量瓶中，加水定容至刻度后搖勻，取5.00mL 至20mL，搖勻即得。
2.3 系統適用性試驗
按“2.1”項條件，精密量取“2.2”項下各溶液 20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明：空白溶劑基線平穩，各輔料對硫酸奈替米星含量測定無干擾。西索米星的保留時間約為10.4min，奈替米星的保留時間約為12.9min，西索米星峰與奈替米星峰間分離度為5.2，奈替米星峰與其1.1倍保留時間峰的分離度為1.8，以奈替米星峰計理論板數為10777，系統適用性溶液連續進樣6針，奈替米星峰面積RSD為0.5%，符合HPLC定量分析的要求，典型色譜圖見圖1。
2.4 色譜柱的選擇
選取Phenomenex-Gemini-NX C18、WatersXBridge Shield RP18及Agilent ZORBAX SB-C18 3個常用品牌的色譜柱，進行系統適用性考察的典型色譜見圖2，西索米星峰與奈替米星峰，奈替米星峰與后相鄰峰的分離度見表1。
結果表明：3款色譜柱均符合美國藥典的要求，其中兩款符合新建色譜系統適用性要求，說明本方法對色譜柱的耐用性比較好。
2.5 線性與范圍
取奈替米星標準品適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成0.1，0.2，0.25，0.5及1.0mg/mL的標準品溶液。精密量取各濃度標準品溶液20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以各溶液的濃度(mg/mL) 為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，進行線性回歸，繪制回歸曲線并計算相關系數及回歸方程，所得線性回歸方程為Y=7838562X+24536(r=1.0000)。結果表明硫酸奈替米星濃度在0.1~1.0mg/mL范圍內與峰面積的線性關系良好。
2.6 檢測限與定量限
取線性項下濃度為0.2mg/mL的標準品溶液經系列稀釋后進樣檢測，按信噪比約為3計算，奈替米星的檢測限為20ng，按信噪比約為10計算，奈替米星的定量限為40ng。結果表明：該方法靈敏度高。
2.7 重復性
取A廠家批號為1511076的硫酸奈替米星注射液6 份，按“2.2”項制備供試品溶液，按“2.1”項進樣分析，按外標法計算含量，所測含量RSD為0.20%(n=6)，表明該方法重現性良好，各樣品含量見表2。
2.8 回收率試驗
精密稱定奈替米星(批號：01-05013-151103)12.5mg兩份，分別置于50mL量瓶中，加水溶解，用水稀釋至刻度，測定其含量。根據廠家處方工藝，分別稱取EDTA-二鈉、檸檬酸鈉、L-半胱氨酸與硫酸奈替米星適量，按制劑處方量配制硫酸奈替米星注射液空白輔料母液。另取奈替米星(批號：01-05013- 151103)10、12.5及15.625mg各3份，分別置于50mL 量瓶中，分別加入相應處方量的輔料母液，加水溶解，用水稀釋至刻度，作為回收率供試品溶液，分別精密量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定含量，計算回收率。
按處方量配制3個濃度水平的9份硫酸奈替米星溶液，記錄所得色譜圖峰面積，按外標法計算含量和回收率。平均回收率為98.51%，RSD為0.5% (n=9)，結果表明：本方法回收率良好，準確度較高，各濃度樣品含量數據見表3。
2.9 溶液穩定性
精密稱定奈替米星原料(批號：01-05013- 151103)12.5mg，置于50mL量瓶中，加水溶解，用水稀釋至刻度，分別在0、2、4、6、8和10h時，精密量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法計算各時間點樣品含量的RSD。結果表明：各時間點含量的RSD為0.2%(n=6)，結果表明溶液至少在10h 內的穩定性是良好的。
2.10 小結
改進的高效液相色譜法測定硫酸奈替米星含量具有操作簡便快捷、專屬性強、線性范圍寬，精密度和準確度高，重復性好等優點。
相關期刊推薦：《中國抗生素雜志雜志》創刊于1976年，本刊為月刊，現為全國中文核心期刊(為全國藥學類，北大2008版中文核心期刊目錄)，是中國科技論文統計源期刊(中國科技論文核心期刊)(2008版科技論文統計源期刊目錄期刊)，分別于1992、1996、2000、2004年被列入《全國中文核心期刊要目總攬》，被國內幾乎所有數據庫、文獻檢索系統收載、是我國微生物藥物領域對外交流的重要窗口。有投稿需求的作者，可以直接與期刊天空在線編輯聯系。
3 液相色譜測定方法與抗生素微生物檢定方法的等效替代可行性考察
3.1 中檢院硫酸奈替米星標準品與美國藥典(USP)硫酸奈替米星對照品轉換系數的確定
由于中國藥典和歐洲藥典規定的含量測定方法均為抗生素微生物檢定法(效價法)，因此中檢院的標準品和歐洲藥典的標準品標示的含量均為效價值，中檢院標準品標示含量為577IU/mg，歐洲藥典標準品標示含量為14656IU/瓶。USP標準為液相紫外測定方法，其對照品每瓶為500mg，為濕品，干燥條件：110℃減壓干燥至少3h，標示含量：以干燥品計為65.5%。我們以卡爾費休氏法測定了USP對照品的水分為11.99%，將USP濕品對照品含量直接折算為 57.65%，然后以USP對照品濕品為對照品測定中檢院標準品含量為56.9%。計算出純品效價和絕對含量之間的轉換系數F(IU/mg)為1.014。
3.2 含量測定及量效轉換后結果與效價結果的統計學分析
以中檢院標準品為對照品，按“2.1”項下方法對來自10個廠家的64批次硫酸奈替米星注射液進行含量測定，按外標法計算含量。結果表明，64批次樣品均符合標準規定。同一樣品由HPLC測得結果的 RSD較抗生素微生物檢定法測得結果的RSD低，表明HPLC方法的精密度優于微生物檢定法。
將高效液相色譜法測得的含量乘以轉換系數F，計算出樣品的標示含量，然后以該標示含量與微生物效價法測定的含量進行統計分析。采用SPSS軟件將兩種方法所測的結果進行統計分析，結果發現兩種方法所得結果差異不顯著(P=0.15>0.05)。說明兩種含量測定方法有替代的可能。
3.3 量效統一性考察
根據USP通則1223.1中替代抗生素微生物檢定法的驗證要求，本實驗以USP硫酸奈替米星對照品為對照，按照建立的高效液相色譜法標化中檢院標準品含量，計算純品效價和絕對含量之間的轉換系數F。以中檢院標準品為對照，測定樣品的標示含量，乘以轉換系數得到量效轉換后效價含量。將量效轉換后效價含量與微生物法測定的效價含量進行統計分析比較，結果符合Ep.2[-kMicro
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