基于代謝組學分析馬齒莧根莖葉中 4 種重要次生代謝產物

發布時間：2022-05-10所屬分類：農業論文瀏覽：1次

摘 要： 摘 要：【目的】 探究馬齒莧重要次生代謝產物成分及其在不同部位相對含量及聯系�！痉椒ā� 以馬齒莧根莖葉為研究對象，利用高效液相色譜串聯質譜進行代謝組學分析。【結果】 馬齒莧中生物堿、類黃酮、香豆素與木脂素以及萜類所含的種類及化合物分別有 3 類 43 種、7 類

　　摘 要：【目的】 探究馬齒莧重要次生代謝產物成分及其在不同部位相對含量及聯系�！痉椒ā� 以馬齒莧根莖葉為研究對象，利用高效液相色譜串聯質譜進行代謝組學分析。【結果】 馬齒莧中生物堿、類黃酮、香豆素與木脂素以及萜類所含的種類及化合物分別有 3 類 43 種、7 類 34 種、2 類 16 種和 3 類 5 種，熱圖分析表明，這 4 類次生代謝產物在馬齒莧莖和葉中的相對含量較根部更為接近;生物堿在根部和葉部總體含量較高;類黃酮在莖部總體含量較高;萜類以及香豆素與木脂素在根莖葉部含量依次遞增�！窘Y論】 馬齒莧不同部位所含生物堿、類黃酮、香豆素與木脂素以及萜類種類相同，但相同成分在不同部位含量差異較大。

　　關鍵詞：馬齒莧;代謝組學;代謝產物;化合物;成分分析

　　0 引言

　　【研究意義】植物次生代謝產物包括生物堿、萜類及類黃酮等，這些次生代謝產物不僅有益植物自身對逆境的忍耐力，同時，也是人類生活必不可少的重要物質，涉及營養保健、天然色素、天然藥物或者藥物前體等應用[1]。馬齒莧科馬齒莧屬馬齒莧(Portulaca oleracea L.)被列為首批 78 種藥食同源植物之一[2]，廣泛分布于我國大江南北以及東南亞、南亞、中東、中歐等世界各地[3−5]。馬齒莧富含生物堿、萜類、黃酮類以及香豆素與木脂素等重要次生代謝產物，但不同地區馬齒莧品種不同，相關次生代謝產物含量也略有差異[6]。【前人研究進展】傳統上，人們習慣將馬齒莧作為野菜或中草藥來使用[7,8]，現代研究證實其含有生物堿、黃酮類、萜類及香豆素類等重要次生代謝產物活性成分[9−12]，具有降血糖血脂、預防心血管疾病、增強人體免疫力、抗過敏、抗菌、抗病毒、抗衰老、抗腫瘤及抗動脈粥樣硬化等多種功效[13−15]。馬齒莧的化學成分復雜，種類較多，目前有大量關于馬齒莧化學成分測定及提取等研究報道[16,17]，但由于提取技術原因，導致所測馬齒莧成分不全[18,19]。同時，不同地區的馬齒莧野生種群間存在成分差異，同一種群馬齒莧受土壤及氣候條件等影響，具體成分或含量也有差異[20]�！颈狙芯壳腥朦c】代謝組學是對生物體在某一生理時期，相對分子量在 1000 以內的小分子代謝物系統進行分析的一門新型學科[21,22]。因此采用該技術可準確分析馬齒莧根莖葉在某一生理時期重要次生代謝產物的具體成分和相對含量�！緮M解決的關鍵問題】本研究以福建閩南及廣東潮汕等地區常見馬齒莧野生種為研究對象，利用高效液相色譜串聯質譜(UPLC- MS/ MS)進行葉、莖和根代謝組學分析，以期系統獲取馬齒莧中生物堿、類黃酮、香豆素與木脂素以及萜類等重要次生代謝產物的具體成分和相對含量，為進一步進行馬齒莧相關功效成分提取利用等研究工作打下良好基礎。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗材料在夏季 7 月中旬，從福建省農業科學院亞熱帶農業研究所種質資源圃采取長勢茂盛的綠葉、紅莖和白根的馬齒莧野生種，取根、莖和葉各 3 個生物樣重復，每份約 60 g，用 75% 酒精洗凈甩干后裝入自封袋標號，快速保存于−80 ℃ 超低溫冰箱備用。

　　1.2 試驗方法

　　1.2.1 樣品提取 從−80 ℃ 超低溫冰箱取出待測樣品于凍干機中真空冷凍干燥后，利用研磨儀在 30 Hz 頻率下研磨干燥樣品 1.5 min 至粉末狀;每個樣品粉末各稱取 100 mg 溶解于 0.6 mL 70% 的甲醇提取液;為提高提取率，樣品提取液需放置于 4 ℃ 冰箱過夜且期間渦旋 6 次;進一步在轉速 10 000 g 離心 10 min 后取上清液，用 0.22 μm pore size 微孔濾膜過濾樣品后保存于進樣瓶中，用于 UPLC-MS/MS 測試分析。

　　1.2.2 色譜分析 利用超高效液相色譜(Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A， https://www.shimadzu. com.cn/)分析馬齒莧樣品所需條件為：色譜柱(1.8 μm，2.1×100 mm)流動相 A 相和 B 相皆為加入 0.04% 乙酸的超純水和乙腈。洗脫梯度中 5%～95% B 相， 0～10 min;95% B 相維持 10～11 min;95%～5% B 相，11～11.1 min;5% B 相維持至 14 min。液相色譜流速為 0.35 ml·min−1;柱溫維持在 40 ℃ 條件;進樣量為 4 μl。

　　1.2.3 串聯質譜分 串聯質譜(Applied Biosystems 4500 QTRAP，http://www.appliedbiosystems. com.cn/)條件中電噴霧離子源(ESI)溫度為 550 ℃，質譜電壓在 5500 V 下，簾氣(CUR)壓力為 30 psi，碰撞誘導電離(CAD)時所設置的參數為高。三重串聯四級桿質譜(QQQ)原理中，通過優化的去簇電壓(DP)及碰撞能(CE)進行每個離子對掃描檢測[23]。

　　1.2.4 代謝物的定性與定量 根據百邁客科技有限公司所建的采用化學標品或同公共庫的二級譜圖進行比對建立的數據 庫 MWDB(metware database)，通過二級譜信息進行代謝物的定性，分析時去除了 K +、Na+、NH4 +及大分子量物質的碎片離子等同位素重復信號。利用軟件 Analyst 1.6.3 處理質譜數據。同時，利用 QQQ 質譜的多反應監測模式(MRM)進行代謝物定量。在 MRM 模式中，通過四級桿篩選代謝物母離子時，需排除其他分子量物質對應的離子。母離子經電離后斷裂形成的碎片離子，再通過 QQQ 過濾選擇，獲得所需要的一個特征碎片離子。以上定性定量后獲得馬齒莧根、莖和葉各 3 個樣本的代謝物質譜分析數據后，對所有物質質譜峰進行峰面積積分和積分校正，具體步驟詳見參考文獻[24]。

　　1.2.5 數據統計分析 利用 WIN7 DPS 7.05 版軟件對數據進行統計學分析，采用 LSD 法進行多重比較，字母表示結果取 5% 顯著水平。

　　2 結果與分析

　　2.1 馬齒莧 4 種次生代謝產物分析

　　在馬齒莧根莖葉各 3 個生物學重復共 9 個樣品中，檢測到化合物有生物堿類 43 種、黃酮類 34 種、香豆素與木脂素 16 種、萜類化合物 5 種。在馬齒莧根莖葉中進行相關代謝產物相對含量熱圖分析，結果表明(圖 1)：以上 4 類次生代謝產物在莖和葉中的相對含量較根部更為接近;生物堿在根部和葉部含量高于莖部;類黃酮在莖部含量高于根部和葉部;香豆素與木脂素以及萜類在根莖葉部含量依次遞增。

　　2.2 43 種生物堿分析

　　通過化學標準品驗證或通過公共庫的二級譜圖進行比對，共獲取 43 種生物堿，分為酚胺、生物堿及吲哚類生物堿等 3 類(表 1)，其化合物分別有 12、25 和 6 種。這些化合物中，N-反/順式阿魏酰酪胺在根部含量較高;馬齒莧酰胺 B 和膽堿在葉部含量較高;而 N'-阿魏酰腐胺、馬齒莧酰胺 C 和 2,4-二羥基-7-甲氧基-1,4-苯并惡嗪-3-酮在根部含量極低， 5-羥基吲哚-3-乙酸在葉部含量極低。 2.3 34 種黃酮類分析相關研究方法所獲取的 34 種黃酮類化合物中，分為 6 類(表 2)，具體包括：黃烷醇、異黃酮、黃酮碳糖苷、黃酮醇、黃酮、二氫黃酮醇和花青素，其化合物分別為 4、2、6、9、10、1和 2 種。這些化合物中，山柰酚 3-O-β-(2″-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸) 和橙皮素 O-丙二�；�己糖苷在莖和葉部含量均較高;而含量較低的化合物較多，其中葉部 3 種、莖部 2 種、根部 10 種。

　　2.4 16 種香豆素與木脂素分析

　　16 種香豆素與木脂素中，木脂素所含化合物為 10 種，香豆素所含化合物為 6 種(表 3)。這些化合物中，秦皮甲素和七葉苷在莖和葉中含量均較高;松脂醇二葡萄糖苷在莖和根部含量顯著低于葉部;丁香樹脂酚-乙酰葡萄糖在莖部含量極低，丁香樹脂酚-己糖在根部含量極低。

　　2.5 5 種萜類化合物分析

　　5 種萜類化合物包括 3 種倍半萜以及三萜和三萜皂苷各 1 種(表 4)。這些化合物中，獐牙菜苷在葉部含量較高，獐牙菜苦苷在莖葉部含量均較高;3'- O-D-葡萄糖酰龍膽苦苷在根部含量極低，鐵冬青酸在莖和葉部含量均極低。

　　3 討論與結論

　　馬齒莧作為傳統的藥食同源植物，一直以來不斷有類黃酮、生物堿及萜類等相關成分的研究報道 [25−27]，但受限于技術手段和研究方法，相關成果不夠系統，所測成分也不夠全面[28]，因此，相關文獻報道所獲具體成分數量偏少或相關成分具體含量存在較大誤差。高效液相色譜串聯質譜可對植物的具體成分進行系統性的定性定量分析，本研究通過高效液相色譜串聯質譜進行馬齒莧代謝組學分析，首次系統獲取其生物堿類、黃酮類、萜類化合物、香豆素與木脂素等 4 類重要次生代謝產物，發現其化合物分別有 43、34、16 和 5 種。對以上代謝產物在馬齒莧根莖葉中的相對含量進行熱圖分析，發現該 4 類次生代謝產物在莖和葉中的相對含量較根部更為接近;通過比較 4 類重要次生代謝產物在馬齒莧根莖葉中的含量可知，生物堿在莖部總體含量偏低，類黃酮在莖部總體含量偏高，香豆素與木脂素以及萜類在根莖葉部含量依次遞增。由于生物堿類、黃酮類、萜類化合物、香豆素與木脂素等 4 類重要次生代謝產物共 98 種化合物在馬齒莧根莖葉部的具體含量差異明顯，因此，本研究對該 98 種化合物進行歸類，同時詳細列舉了各化合物在根、莖和葉部的相對含量，為進一步從事馬齒莧上述功效成分提取利用及功效評價等工作提供理論依據。

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　　雖然不同地區馬齒莧野生種群不同，且受土壤及氣候條件等影響，即使同一種群馬齒莧的具體成分或含量也存在差異[29,30]，但同科屬的馬齒莧絕大多數相關成分及其含量差異不明顯。本文以福建閩南及廣東潮汕等地區常見馬齒莧野生種群為研究對象，對其根、莖和葉的相關重要次生代謝產物進行定性定量分析，從而系統闡述了該地區馬齒莧根、莖和葉片中所含生物堿類、黃酮類、萜類化合物、香豆素與木脂素等重要次生代謝產物及其相對含量，為其他地區馬齒莧種群相關成分及含量等研究提供參考意義。——論文作者：張少平，李 洲，練冬梅，姚運法，賴正鋒，吳松海，鞠玉棟*，洪建基*

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