發布時間：2022-05-09所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要 褪黑素具有調節晝夜節律、抗氧化等生物活性，因此測定不同類型馬齒莧的褪黑素含量，可為后續開發馬齒莧相關功能性產品提供理論依據。采用高效液相色譜法測定馬齒莧褪黑素，色譜柱為 Angilent 5 TC-C18 (250 mm4.6 mm, 5 m);流動相為 50 mmol/L 磷酸氫二鈉(pH=4.5
摘 要 褪黑素具有調節晝夜節律、抗氧化等生物活性，因此測定不同類型馬齒莧的褪黑素含量，可為后續開發馬齒莧相關功能性產品提供理論依據。采用高效液相色譜法測定馬齒莧褪黑素，色譜柱為 Angilent 5 TC-C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動相為 50 mmol/L 磷酸氫二鈉(pH=4.5)-乙腈(77:23);柱溫為 28 ℃;流速為 1 mL/min;進樣量為 10 μL;檢測波長為 223 nm。結果表明褪黑素在 100~4 000 ng/mL 濃度范圍內與峰面積的線性關系良好(R=0.9999)，平均加樣回收率為 99.58%，RSD 值為 1.83%，六個馬齒莧干燥飲片的褪黑素含量在 0~35.917 ng/g，其中河北產地的褪黑素含量最高，而在山東、四川和江蘇等產地中未檢測到褪黑素成分;六個馬齒莧新鮮葉片中褪黑素含量在 0.493~139.911 ng/g，其中荷蘭類型的褪黑素含量最高，而在莖中未檢測到褪黑素成分。因此，馬齒莧褪黑素的含量差異性不僅體現在不同類型之中，同時在同一樣品的不同部位之間也存在較大差異，其中以荷蘭類型的馬齒莧鮮品為佳。
關鍵詞 馬齒莧; 褪黑素; HPLC
褪黑素，一種具有調節晝夜節律、抗氧化、神經保護等功能的吲哚胺類物質(Marino and Hernndez-Ruiz, 2018)，作為膳食補充劑的使用占全球褪黑素需求的 52.5% (Pérez-Llamas et al., 2020)。目前市場上的褪黑素膳食補充劑基本上是由合成褪黑素制成的，然而褪黑素在合成過程中會伴隨著大量副產品的出現，比如1,1'- 乙叉二膦-色氨酸(Peak E)，5-羥色胺衍生物，5-甲氧基色胺衍生物等(Williamson et al., 1997; Naylor et al., 1999)。這些副產品通常是與色氨酸相關的化合物，如 Peak E，與嗜酸性粒細胞肌痛綜合征(EMS)有關，一種無法治愈和致命的疾病(Williamson et al., 1998; Cerezo et al., 2016)。此外，還有一些非常快速、簡單和廉價的方法如由鄰苯二酰亞胺合成褪黑素的途徑，該方法不僅可產生多種污染物，且需要有毒的底物或催化劑(Prabhakar et al., 1999; He et al., 2003; Thomson and Aurélien, 2003)。雖然現代一些化學合成色氨酸衍生物的方法可以減少副產品的出現(Bartolucci et al., 2015; 2016)，但是市場上對于褪黑素的合成污染物也無法得到完全的排除。因此，尋找替代人工合成的褪黑素具有重大意義。
在很長一段時間里，褪黑素被認為是動物里特有的一類神經激素，直到 1995 年，Dubbels 等(1995)發現在高等植物中也存在褪黑素。有研究表明，芳香植物與藥用植物具有較高的褪黑素，同時植物褪黑素還 “伴隨”其他抗氧化活性物質如酚類、黃酮類、類胡蘿卜素等(Pérez-Llamas et al., 2020)，這些物質可能與褪黑素產生協同作用進而增強褪黑素的生物活性，可作為提取植物褪黑素的重要植物來源。馬齒莧(Portulaca oleracea L.)為馬齒莧科(Portulacaceae)馬齒莧屬(Portulaca)一年生草本，具有清熱解毒，涼血止血等功效，可用于熱毒血痢、濕疹、丹毒，在中國南北各地均產，資源豐富，屬于藥食同源的一種植物(Zhou et al., 2015)。有研究者發現在新鮮馬齒莧中存在褪黑素(Simopoulos et al., 2005)，同時課題組前期也在江蘇馬齒莧干燥飲片中測得褪黑素含量為 686.17 ng/g (瞿星洪和可燕, 2020, 中國食物與營養, 26(11): 77-81.)，在植物中處于較高水平。然而植物中褪黑素含量的累積易受到環境條件影響，由于馬齒莧分布的廣泛性，其褪黑素含量可能存在地域差異性。因此，本研究對不同類型馬齒莧的褪黑素含量進行測定，為后續開發馬齒莧相關功能性產品提供理論依據。
1 結果與分析
1.1 樣品中褪黑素的分離效果
在“3.5”項條件下，馬齒莧樣品中的褪黑素分離良好，無雜質峰干擾(圖 1)。
1.2 線性關系考察
按“3.5”項下色譜條件進樣三次，以對照品褪黑素濃度為橫坐標，平均峰面積為縱坐標，計算得線性回歸方程為 A=0.0694C-4.4938 (R=0.9999)，結果表明，褪黑素在 100~4 000 ng/mL 濃度范圍內線性關系良好。
1.3 精密度、重復性和穩定性試驗
分別取標準品褪黑素溶液和馬齒莧樣品溶液，按“3.5”項下色譜條件測定六次，計算得到標品和樣品的褪黑素峰面積 RSD 值分別為 0.78%和 1.60%，表明該方法精密度和重復性良好。取馬齒莧樣品溶液，分別于 0、2、4、8、12 和 24 h 按“3.5”項下色譜條件測定，計算得到樣品褪黑素峰面積的 RSD 值為 1.71%，表明褪黑素樣品在 24 h 內穩定性良好。
1.4 加樣回收率試驗
取加標后制備的樣品溶液適量，按“3.5”項下色譜條件進行液相測定，計算得到馬齒莧褪黑素的平均加樣回收率為 99.58%，RSD 值為 1.83% (表 1)。
1.5 樣品含量測定
取馬齒莧各個樣品制備的供試品溶液適量，按“3.5”項下色譜條件進樣三次，計算樣品中褪黑素的含量 (表 2; 表 3)。根據馬齒莧干燥飲片的褪黑素含量測定結果可知，六個馬齒莧干燥飲片的褪黑素含量在 0~35.917 ng/g，河北產地的馬齒莧褪黑素含量最高，其次是浙江、廣東，但在山東、四川和江蘇產地的馬齒莧飲片里未檢測到褪黑素成分，而課題組前期在江蘇馬齒莧中測得較高褪黑素含量 686.17 ng/g，這表明馬齒莧褪黑素含量不僅存在顯著的地域差異性，不同批次之間也存在較大差異。有研究發現植物褪黑素的含量可隨著植物的生長發育變化而變化(Korkmaz et al., 2014)，不同的加工處理方式對于褪黑素含量也具有不同程度的影響(Pothinuch et al., 2011)。由于國內馬齒莧資源的分散性與野生型等特征，該藥材來源于各個地區藥農的采集，在采收地點、采收時間以及藥材處理方面均缺乏統一標準，所以以上因素均很有可能導致不同產地以及不同批次藥材的差異性。本實驗還對不同馬齒莧新鮮樣品中褪黑素進行葉和莖的分開測定，六個新鮮馬齒莧中葉片褪黑素的含量在 0.493~139.911 ng/g，其中荷蘭類型葉片中的褪黑素含量最高，且遠遠高于其他五個馬齒莧樣品，同時也遠遠高于 Simopoulos 等(2005)在新鮮馬齒莧葉片中測得的褪黑素含量 19 ng/g，但是在莖中未檢測到該成分。因此，馬齒莧褪黑素含量不僅在不同類型中存在顯著差異，在同一樣品的不同部位中也存在較大差異。
2 討論
本研究分別考察了乙腈-水、0.1%甲酸-乙腈和 50 mmol/L 磷酸氫二鈉(pH=4.5)-乙腈等流動相體系。結果表明 50 mmol/L 磷酸氫二鈉(pH=4.5)-乙腈作為流動相時，馬齒莧褪黑素能得到很好的分離，且無雜峰干擾，同時該方法靈敏度高，重復性好，可用于不同類型馬齒莧褪黑素的含量測定。
植物中褪黑素的含量水平一般在 pg/g~ng/g 之間，雖然含量較低，但研究表明植物褪黑素可被胃腸道吸收，血液褪黑素水平得到顯著的提升，同時有研究表明給予大鼠相同劑量的豆芽褪黑素提取物與人工合成褪黑素，前者的血漿褪黑素水平是后者 1.2 倍(Rebollo-Hernanz et al., 2020)。此外，年輕人、中年人和老年人攝入含褪黑素的甜櫻桃、李子或葡萄汁不僅可以提高機體的抗氧化能力(Garrido et al., 2010; Gonzalez-Flores et al., 2011; 2012)，其睡眠質量參數如睡眠潛伏期和睡眠時長都得到積極的改善(Howatson et al., 2012; Garrido et al., 2013)。這說明通過攝入植物褪黑素提高體內的褪黑素水平以改善身體機能是一個很好的選擇。就植物褪黑素而言，它是一種天然的物質來源，排除任何由于化學合成而污染的可能性，相比合成褪黑素更容易被大眾所接受。因此，可選擇富含褪黑素的植物進行提取與富集。
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馬齒莧，一種藥食兩用的植物，資源豐富，價廉易得。本實驗基于褪黑素調節晝夜節律、改善睡眠質量、抗氧化等生物活性以及課題組前期在江蘇馬齒莧干燥飲片中檢測到較高含量的褪黑素，對不同類型馬齒莧褪黑素的含量進行測定，結果表明不同類型馬齒莧之間其褪黑素含量存在差異性，不同批次也存在較大差異，同時在一些馬齒莧樣品中未檢測到褪黑素成分，一方面可能本身就不存在褪黑素，另一方面可能與該批馬齒莧的采摘期有關，Afreen 等(2006)對于常用的藥用植物甘草研究發現，褪黑素在 3~6 個月植株的根中可以檢測到，但在 1 個月植株的根組織中卻檢測不到褪黑素的存在，而馬齒莧在不同時期褪黑素的含量是否也存在類似現象還有待進一步考察。本次實驗測得馬齒莧干燥飲片的褪黑素含量都較低，結合褪黑素不穩定、易氧化降解性質，在加工、儲存過程中都會對褪黑素成分造成不同程度的損失，所以為了能夠最大化的獲取植物中的褪黑素，更宜選擇馬齒莧鮮品。此外，本實驗所研究的馬齒莧鮮品均是在同一環境條件下由種子繁殖而來的，但從樣品測定結果來看，不同馬齒莧樣品之間褪黑素含量存在顯著差異，所以褪黑素含量的差異性不僅是受環境因素影響，植物本身的遺傳特性也發揮著一定的作用。從馬齒莧鮮品中葉與莖的褪黑素測定結果可得，就植物褪黑素而言，食用新鮮馬齒莧葉片的營養價值遠高于莖的，作為中國主要栽培品種荷蘭馬齒莧相比其他類型的馬齒莧不僅在褪黑素含量上占顯著優勢，同時該類型可周年供應，有機規模種植，避免了農藥污染、更安全、衛生，具有更好的應用前景，可作為提取植物褪黑素的備選馬齒莧類型。
3 材料與方法
3.1 實驗材料
褪黑素(批號:KJ1807CA14, HPLC≥98%, 上海源葉生物技術有限公司)。
馬齒莧樣品，S1~S6 為馬齒莧干燥飲片，S7~S12 為馬齒莧新鮮藥材，經上海中醫藥大學可燕教授鑒定為馬齒莧科植物馬齒莧 Portulaca oleracea (表 4)。
3.2 儀器與試劑
Angilent 1260 型高效液相色譜儀(美國 Angilent 公司);旋轉蒸發器 RE-52AA (上海亞榮生化儀器廠); Eppendorf 離心機(Gene Company Limited);固相萃取小柱 Bond Elut C18，500 mg 6 mL (美國 Angilent 公司);潔盟牌超聲波清洗機(深圳市潔盟清洗設備有限公司)。
乙腈、甲醇、磷酸以及磷酸氫二鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)均為色譜純。
3.3 標準品溶液制備
精密稱取褪黑素標準品適量，甲醇溶解，配制成 0.1mg/mL 的標準品母液。
3.4 供試品溶液制備
對 Chen 等(2003)提取褪黑素方法進行改進提取馬齒莧褪黑素。新鮮馬齒莧的葉與莖液氮研磨成粉末，干燥馬齒莧打粉過篩。稱取馬齒莧粉末 20.0 g，置于 200 mL 棕色廣口瓶中，加入 120 mL 甲醇冰水浴超聲提取 30 min，4 000 r/min 離心 15 min，取上清液于圓底燒瓶中，通過旋轉蒸發器將其旋干，殘渣取 50%甲醇 6 mL 溶解，所得溶液過 0.22 μm 濾膜后轉入分別經 5 mL 甲醇和 5 mL 超純水活化后的固相萃取小柱，先取 10%甲醇 5 mL 沖洗除去部分雜質，最后取 80%甲醇 1 mL 洗脫，收集的洗脫液過 0.22 μm 濾膜后置于棕色 EP 管備用。提取過程應全程避光。
3.5 色譜條件
色譜柱為 Angilent 5 TC-C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動相：50 mmol/L 磷酸氫二鈉(pH=4.5)-乙腈 (77:23);柱溫：28 ℃;流速：1 mL/min;進樣量：10 μL;檢測波長：223 nm。
3.6 線性關系考察
取褪黑素標準品母液分別配制成濃度為 100、200、500、1000、2000、4000 ng/mL 溶液。按“3.5”項下色譜條件進行液相測定，平行進樣三次，以標準品褪黑素濃度為橫坐標，平均峰面積為縱坐標，進行線性回歸。
3.7 精密度、重復性和穩定性試驗
取標準品褪黑素溶液按“3.5”項下色譜條件測定六次，計算褪黑素峰面積的相對標準偏差(RSD)。稱取 S1 馬齒莧粉末 20.0 g，平行 6 份，按“3.4”項下方法制備馬齒莧樣品溶液，按“3.5”項下色譜條件測定并計算褪黑素峰面積的 RSD。稱取 S1 馬齒莧粉末 20.0 g，平行 6 份，按“3.4”項下方法制備馬齒莧樣品溶液，分別于 0、2、4、8、12、24 h，按“3.5”項下色譜條件測定并計算褪黑素峰面積的 RSD。
3.8 加樣回收率試驗
取已知成分含量的 S1 馬齒莧粉末 20.0 g，平行 6 份，精密加入標準品褪黑素 400 ng，按“3.4”項下方法制備馬齒莧樣品溶液，按“3.5”項下色譜條件測定并計算褪黑素的平均加樣回收率及 RSD。
3.9 樣品含量測定
取馬齒莧各個樣品，按“3.4”項下方法制備馬齒莧樣品溶液，按“3.5”項下色譜條件進樣三次，計算馬齒莧褪黑素的含量。
作者貢獻趙琦是本研究的實驗設計者和實驗研究的執行人，完成數據分析，論文初稿的寫作;蔣嘉燁，趙可，鄧劍宇參與實驗設計和試驗結果分析;可燕是項目的構思者及負責人，指導實驗設計、數據分析、論文寫作與修改。全體作者都閱讀并同意最終的文本。——論文作者：趙琦 可燕* 蔣嘉燁 趙可 鄧劍宇
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