發布時間：2022-03-06所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：三相分離(TPP)是將硫酸銨與叔丁醇混合后形成有機相、中間沉淀相和水相。在20。C，調節發酵上清波的pH至6.o，加入硫酸銨使終濃度為400 g/L，溶解后加入與上清液等體積的叔丁醇，靜置1 h分相，膽固醇氧化酶在有機相和水相之間形成蛋白沉淀，12 ooo r/min離心10 min
摘要：三相分離(TPP)是將硫酸銨與叔丁醇混合后形成有機相、中間沉淀相和水相。在20。C，調節發酵上清波的pH至6.o，加入硫酸銨使終濃度為400 g/L，溶解后加入與上清液等體積的叔丁醇，靜置1 h分相，膽固醇氧化酶在有機相和水相之間形成蛋白沉淀，12 ooo r/min離心10 min 收集中間蛋白相，用pH 7.5，10 mmol/L的磷酸緩沖液溶解。結果表明;利用三相分離技術從乳化體系中分離純化膽固醇氧化酶，比酶活提高了3.49倍，收率迭93%�；厥盏拿敢哼M一步經過 DEAE—Sepharose Fast Flow純化，比酶活從3.56 U/mg提高到30.15 U/mg。該酶最適反應溫度為60。C，最適反應pH為7.5，酶的等電點為8.5，該酶在37。C，pH 6.o～8.o較為穩定。H92+和 Ag+離子完全抑制膽固醇氧化酶的活性。
關鍵詞：甾短桿菌;膽固醇氧化酶;分離純化;三相分離;酶學性質
膽固醇氧化酶(ECl.1.3.6，COD)是依賴輔酶 FAD，能專一性地催化膽固醇轉化為膽甾一4一烯一3一酮‘¨，在食品開發、醫療保健、臨床檢測、生物農藥等方面具有廣泛應用價值。產膽固醇氧化酶的微生物有多種，如節桿菌、馬紅球菌、諾卡氏菌、假單胞菌、鏈霉菌，不同來源的膽固醇氧化酶的生理特性及底物特異性不同[2]。本實驗室從土壤中篩選得到一株膽固醇氧化酶生產菌B卯口i施c￡eri“m sp.DGCDC82[3‘。
膽固醇和酵母膏是生產膽固醇氧化酶的最佳碳源和氮源[4]。因此膽固醇在培養基中的分散效果是影響產酶的重要因素。利用表面活性劑乳化膽固醇對產酶有重要作用D]。本實驗室利用表面活性劑 Tween一80、異丙醇和橄欖油乳化膽固醇對產酶有顯著作用印]。這主要是因為提高了膽固醇在培養基中乳化穩定性促進了它的分散效果，從而促進了它對 B化口i施f￡P一“優sp.DGCDC-82產酶的誘導效果。
在膽固醇氧化酶的提取過程中，硫酸銨鹽析是最常見的方法[7~8]。但是在作者的實驗過程中，由于殘留的膽固醇、Tween-80和橄欖油形成穩定的混合物，而且與膽固醇氧化酶親合在一起，因此利用硫酸銨鹽析無法有效地將膽固醇氧化酶從乳化體系中分離出來。
三相分離(TPP)是一個簡單的技術，鹽和有機溶劑添加到發酵上清液中[9]。一個小時后三相形成。上相是有機相(包含非極性化合物)，下相是水相(包含極性化合物)，中間層為蛋白質沉淀。作者利用三相分離技術分離膽固醇氧化酶，膽固醇、 Tween一80、橄欖油及色素富集在上相，而酶蛋白濃縮在中間相。這樣既有效地破除了乳化體系又可以達到濃縮純化的效果。雖然成本比硫酸銨鹽析略高，但是純化倍數和收率都比較高。
本文報道了用三相分離和離子交換技術從乳化體系中分離純化膽固醇氧化酶，并對純酶的酶學性質進行了研究。
1實驗材料和方法
1.1材料
1.1.1 茵種 BrP口i6口f￡Pri“，扎 sp.CCTCC M201008，由本實驗室保藏。
1.1.2培養基種子培養基(g/L)：牛肉浸膏3，蛋白胨10，NaCl 5。發酵培養基(L)：膽固醇4 g，酵母膏8.5 g，NaCl 1 g，CH3C00NH4 4 g，K2HP04 O.2 g，MgSQ 0.05 g，FeSOl O.01 g，CaCl2 0.1 mL，Tween-80 3 mL。以上培養基pH調至7.5左右，然后于O.1 MPa下滅菌15 min。
1.1.3 主要生化試劑 DEAE—Sepharose Fast F10w(Pharmacia公司);牛血清蛋白、SDS、丙烯酰胺、N，N，_2亞甲基雙丙烯酰胺，分析純，分子量標準蛋白、等電點標準蛋白均購自Sigma公司;其他生化試劑均為國產分析純。
1.2方法
1.2.1 培養條件 斜面活化48 h，種子在37。C， 220 r/min振蕩培養14～16 h。發酵條件：500 mL 三角瓶裝液量為100 mL，接種量5%，溫度37。C， 220 r/min。
1.2.2膽固醇氧化酶活力的測定 原理：膽固醇在膽固醇氧化酶(COD)的催化下分解成一分子的膽甾一4一烯一3一酮和一分子的H。O。，H：Oz在過氧化物酶的作用下分解，可使4一氨基一安替比林與苯酚形成亞醌類呈紅色的化合物，它在500 nm處有最大吸收峰，通過測量反應液在500 nm處的吸光值，可定量測定膽固醇的氧化量，從而計算出膽固醇氧化酶的酶活單位口]。
操作方法[31：3 mL溶液A(4一氨基一安替比林1 mmol/L，苯酚6 mmol/L，疊氮鈉o.2 g/L，過氧化物酶5 ooO U/L，磷酸鉀緩沖液25 mmol/L pH 7.5)，150“L溶液B(膽固醇8.26 mg/mL，Triton X一100 9=o.042 6，異丙醇為溶劑)，50弘L酶液， 37。C反應5 min，沸水浴3 min，于500 nm測吸光度。酶活(U/mL)=1.683 2×A500。
1.2.3蛋白質濃度的測定 按Lowry法[10]測定，以牛血清白蛋白作標準。
1.2.4 酶的分離與純化 (1)不同種類有機溶劑三相分離效果的比較：室溫條件下，在30 mL發酵上清液中加入硫酸銨，使硫酸銨的終濃度達到300 g/ L，將等體積的有機溶液加入上述溶液中，靜置分相，12 ooo r/min離心10 min，收集中間相，用10 mL pH 7.5的50 mmol/L的磷酸緩沖液溶解后按照標準方法測定酶活和蛋白質濃度。(2)溫度和時間對三相分離效果的影響：改變提取溫度，以上述相同方法收集中間相測定酶活和蛋白質濃度。(3)pH 對三相分離效果的影響：改變pH，其他條件不變，以上述相同方法收集中間相測定酶活和蛋白質濃度。(4)硫酸銨濃度對三相分離效果的影響：20 oC， pH 6.o的條件下，在30 mL發酵上清液中加入不同濃度的硫酸銨，其他條件和操作方法同上，收集中間相測定酶活和蛋白質濃度。(5)叔丁醇濃度對三相分離效果的影響：20。C，pH 6.o的條件下，在30mL發酵上清液中加入硫酸銨、使終濃度為400 g/ L，將叔丁醇以不同的比率加入到發酵上清液中，以上述相同方法收集中間相測定酶活和蛋白質濃度。 (6)離子交換柱操作條件：經三相分離處理，并將透析后的酶液加到已用pH 8.0的10 mmol/L Tris緩沖溶液平衡的離子交換層析柱(2.o cm×40 cm)，先用pH 8.O的Tris緩沖溶液洗柱，再用線性梯度的緩沖液梯度洗脫。平衡和進樣流速為2 mL/min;洗脫流速為3 mL/min;每管收集6 mL，將活性部分收集.
1.2.5酶學性質 (1)最適反應溫度及熱穩定性：在不同溫度下按照標準方法測定酶活，以酶活最高者為100%;酶液分別在65、60、55、50、45、37。C下保溫15 min，迅速冷卻至室溫，按標準方法，測殘余酶相對活力，以未保溫的酶液的酶活為100%。 (2)酶的最適反應pH及pH穩定性：將酶液分別加在pH 5.5～8.5的o.1 mol/L的磷酸緩沖液中，按標準方法測酶活力，以酶活最高者為100%;將酶液用pH 5.5～10.O的緩沖液稀釋，25。C保溫20 h 后，測殘余酶活力，以未保溫的酶液的酶活力 100%。(3)等電點測定：凝膠的濃度75 g/L，載體兩性電解質的pH為3.5～10.O，蛋白質染色用o.5 g/L考馬斯亮藍R-250溶液[1¨。(4)金屬離子對酶活力影響：用10 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.O)配成含2 mmol/L不同金屬離子的緩沖液，與一定量酶液在25。C保溫1 h后，測定膽固醇氧化酶活力。以不含金屬離子反應液為對照。
2實驗結果與討論
2.1 三相分離條件的優化
三相分離是一個簡單而且易于放大的預處理粗酶液的方法，而且不象硫酸銨鹽析那樣在下一步的離子交換之前必須透析脫鹽，三相分離常常可以省略透析脫鹽[12。。影響三相分離效果的因素很多，包括酶蛋白的特性、酶蛋白濃度、pH、離子強度、提取溫度、有機溶劑類型以及處理時間等。因此有必要研究這些因素對三相分離效果的影響，并對三相分離條件進行優化。
2.1.1 不同有機溶劑對三相分離的影響 由表1 可知三相分離純化膽固醇氧化酶時使用叔丁醇作溶劑的收率和比酶活都是最高的，這與Sharma報道的一致[1 3。。這可能是因為叔丁醇的分子大小和分枝結構，使其不容易滲透進入到酶蛋白的折疊結構內部。因此不容易引起酶蛋白變性失活[1引。雖然很多關于三相分離的報道中都是利用叔丁醇作為有機溶劑，但是也有報道利用其他有機溶劑如四氫呋喃等進行三相分離取得較好的結果m1。
2.1.2 不同提取溫度和時間對TPP效果的影響三相分離的溫度和時間是兩個重要的物理參數。由于這兩個參數理論上與其他的物理參數如鹽離子強度、pH和溶劑濃度相比，對三相分離效果的影響較小，所以作者對這兩個因素先進行了確定。提取時間和提取溫度對三相分離效果的影響如圖1。由圖可知，較低的溫度傳質速率較低，三相形成時間較長，增加了酶蛋白與有機溶劑接觸的機會，引起酶蛋白變性。但溫度太高容易使酶變性失活。從圖1中可以看出延長提取時間(即100 min)在較高溫度時 (即30。C)收率明顯下降�；谝陨涎芯拷Y果，最適的提取時間和提取溫度為20。C，60 min。
2.1.3 pH對三相分離效果的影響 在三相分離操作前首先要調節發酵上清液的pH，因為三相分離與傳統的硫酸銨鹽析不同，傳統的硫酸銨鹽析時，遠離等電點處溶解度大，在等電點處溶解度小，因此用中性鹽沉淀蛋白質時，pH常選在該蛋白質的等電點附近。但是三相分離在等電點附近時硫酸鹽的陰離子與陽離子的酶蛋白的靜電相互作用發生急劇下降，所以三相分離效果受到明顯的影響[1引。可以利用這一特性，先調節pH和硫酸銨濃度沉淀雜蛋白，再調節pH和硫酸銨濃度沉淀目的蛋白，達到分級沉淀的目的。從圖2可以看出，pH 6.o時收率和比酶活都比較高，因此，三相分離操作前pH應調節到6.0左右。
2.1.4硫酸銨濃度對三相分離效果的影響 硫酸銨不但具有較強的親水性，而且由于Hofmeister效應，對酶蛋白結構具有穩定作用m]。一般情況下，叔丁醇和水是完全互溶的。但是當加入足夠的硫酸銨后，就會分為兩相，上相叔丁醇相和下相水相。如果最初的溶液中含有酶蛋白，則隨著硫酸銨濃度的增加中間的酶蛋白相將逐漸形成。這是利用三相分離技術分離純化蛋白的基礎。由圖3可以看出，當硫酸銨濃度為400 g/L時比酶活最高，且收率達 92%。
2.1-5叔丁醇濃度對三相分離效果的影響 雖然硫酸根是一個二價的陰離子而叔丁醇是中性分子，但是在三相分離體系中，它們能夠相互加強彼此的物化作用口引。從圖4中可以看出，上清液與叔丁醇體積比為1：1時，收率和比酶活最高。增加叔丁醇濃度，收率和比酶活都會下降，這可能是因為較高濃度有機溶劑容易引起酶蛋白失活。
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由以上的實驗結果可知最優的三相分離條件為：20。C，調節發酵上清液pH到6.O，加入的硫酸銨使硫酸銨終濃度為400 g/L，溶解后加入與上清液等體積的的叔丁醇，靜置1 h分相，12 ooo r/min 離心10 min收集中間蛋白相，用pH 7.5，10 mmol/ L的磷酸緩沖液溶解，在此條件下收率和比酶活分別為93%和3.56 U/mg。
2.2離子交換色譜
將經過三相分離處理后的發酵上清液進一步用 DEAE離子交換柱純化，如圖5。將發酵上清液， TPP處理后的酶液和DEAE純化后的酶蛋白經 SDs_PAGE檢測，結果顯示TPP不但可以破除乳化體系，同時還具有部分純化的作用;樣品經DEAE 進一步純化后，酶蛋白達到電泳純。如圖6所示。整個純化結果如表2所示。
2.3膽固醇氧化酶部分酶學性質
2.3.1 最適反應溫度及熱穩定性 實驗結果表明，酶在37。C保溫15 min殘留98%的活力，高于 65。C時酶活力，說明該酶對高溫敏感，酶的最適反應溫度為60 oC。
2.3.2 最適反應pH及pH穩定性 由實驗結果可知，該酶在pH 6.O～8.O比較穩定;該酶的最適反應pH為7.5。
2.3.3等電點測定 經等電聚焦電泳測定膽固醇氧化酶的等電點為8.5(室溫)。
2.3.4金屬離子對膽固醇氧化酶活性的影響 結果見表3。多種金屬陽離子對該酶都有不同的影響，其中H92+和Ag+離子具有顯著抑制膽固醇氧化酶活性的作用。
3 結論
用三相分離從乳化發酵液中分離純化膽固醇氧化酶，優化后的三相分離條件為：在20。C，調節發酵上清液的pH至6.o，加入硫酸銨使終濃度為400 g/L，溶解后加入與上清液等體積的叔丁醇，靜置 1 h分相，12 ooO r/min離心10 min，收集中間蛋白相，用pH 7.5，10 mmol/L的磷酸緩沖液溶解。經三相分離純化后，膽固醇氧化酶的比酶活提高了 3.49倍，收率達93%�；厥盏拿敢哼M一步經過 DEAEISepharose Fast Fow純化，比酶活從3.56 U/mg提高到30.15 U/mg，收率為64%。對純酶的酶學性質研究結果表明：該酶最適反應溫度為 60。C，最適反應pH為7.5，酶的等電點為8.5，該酶在37℃，pH 6.o～8.o較為穩定。H92+和Ag+ 離子完全抑制膽固醇氧化酶活性。——論文作者：王龍剛， 梁爽， 王武
參考文獻：
[1]呂陳峰，陳毅力，王龍剛，等.利用膽固醇氧化酶轉化膽固醇制備膽甾一4一烯一3一酮[J].無錫輕工大學學報。200l，20(5)： 485—488.
[2]MacLachlan J，wothersp00n A T，Allsell R o，以“.Cholesteml o】【idase：S0urces，physical properti盼and analytical applications [刀.J Steroid Biochem Md Bi01，2000，72：169—195.
[3] 王龍剛，呂陳峰，王 武.Brevibacterium sp.DGCDD82發酵罐中生產膽固醇氧化酶[刀.無錫輕工大學學報，2003，22 (2)：35—37.
[4]LeeMT，Chellwc，choucC Nutritional觸orstht affect the production of cholester01 o五dase by R^odwocc郴∞“no.23 口].Biotechnol Appl Bioch鋤，1997，26：159一162.
[5] Buckland B C。LilIy M D，Dunnill P.The kinetics of choles— ter01 o)【idase synthesis by Nocnrd誼砌odoc^roⅣ5[J]. Bio— techn01 Bioeng，1976，18：60卜621.
[6] Ln c F，wang w，Tang Y x，ef口f.Effect of cholesteroI bio— availability.improving factors on choIesterol oxidase produc— tion by a mutant Bre可i6ncfP一“m sp.DGcDc-82[J].Process Biochem，2002，37：90l一907.
[7] Lartillot s，Kedziora P. Production，puri“cation and some properties of cholesterol o】【idase from a StMp￡o聊yces sp.[J]. Prep Biochem，1990，20：5l一62.
[8] Machang R s，Pfescott J F. Purification and properties of cholesterol oxidase and choline phosphohydr01ase fmm R^odD∞ff“s￡口“[J].Can J Vet Res，199l。55：332—340.
[9] Roy I，shama A，Nath M，甜口z.Recovery of bioIo舒caI activity ill reversibly inactivated proteins by three phase parti— tioning[J]. E眥yme&Micmbial Technology，2005，37： 113一120.
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