發布時間：2022-03-03所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要: 相對于動物和微生物而言，流式細胞術在植物科學上的應用會因植物組織與細胞( 如細胞壁、中央液泡、特殊細胞器等) 的特殊結構以及次生代謝產物等特殊成分，造成樣品在前期處理、染色及測試等方面的困難，甚至導致檢測失敗或結果不準確。筆者在長期運用流式細胞儀
摘 要: 相對于動物和微生物而言，流式細胞術在植物科學上的應用會因植物組織與細胞( 如細胞壁、中央液泡、特殊細胞器等) 的特殊結構以及次生代謝產物等特殊成分，造成樣品在前期處理、染色及測試等方面的困難，甚至導致檢測失敗或結果不準確。筆者在長期運用流式細胞儀測試工作中，積累了大量的植物樣本檢測經驗，并參考國內外相關文獻，總結出從植物取材、樣品制備到植物細胞核 DNA 流式檢測的方法和技巧，可為植物科學研究者及從事流式細胞檢測的技術人員提供實驗參考。
關鍵詞: 流式細胞術; 高等植物; 細胞核 DNA 含量; DNA 解離液
流式細胞儀( flow cytometer) 的誕生標志著在單細胞水平上定性、定量分析及分選檢測技能的快速發展，并在血液學、免疫學、腫瘤學、分子生物學和細胞生物學等學科的基礎研究及臨床檢驗中得到了廣泛應用。但在植物學研究領域中，由于植物組織與細胞結構復雜，使流式細胞儀在植物科學中的應用滯后于其它學科。近 30 年來，隨著流式細胞儀多功能開發、多參數流式分析與分選技術建立、流式樣品制備技術的不斷更新，流式細胞術在植物科學領域如植物遺傳育種、植物染色體分析與文庫構建、逆境植物學、植物分類學、植物病理學等各個學科中顯示出廣闊的應用前景[1]。
大多數生物體遺傳信息編碼的 DNA 定位于細胞核，DNA 含量的檢測技術是開發最早、應用最廣泛、最基本的流式細胞術之一[2，3]。Galbraith 等[2]和 Hare 等[4]研究開發了流式細胞儀檢測植物細胞核 DNA 含量的方法，從而促進了植物學前所未有的發展。流式細胞儀檢測 DNA 含量的原理是利用特殊的熒光染料( PI、DAPI、AO 等) 與細胞內 DNA 堿基結合，在一定的壓力下染色細胞進入流式細胞儀的流動室，經激光照射后發射出熒光，通過濾片可收集到每個細胞相應的熒光強度，再根據染色細胞的熒光強度即可推算出細胞的 DNA 含量。流式細胞術不僅能對植物細胞計數、檢測基因組大小、DNA 含量及其倍性水平、物種入侵能力，還能分選出不同周期不同時期的細胞、染色體及構建文庫等，這為植物細胞生物學研究提供了有力的工具及檢測手段。
利用流式細胞術檢測植物細胞核 DNA 含量和倍性，對描述物種特征、分類及遺傳學研究都十分重要。我們在檢測植物樣品時經常會遇到大量 DNA 碎片的干擾，主要原因是植物細胞結構( 如細胞壁、中央液泡) 及成分( 次生代謝產物等) 的特殊性和復雜性。筆者在長期運用流式細胞儀進行測試的工作中，積累了豐富的植物樣本檢測經驗，同時參考大量的國內外文獻，對植物樣品檢測中的關鍵環節，如植物樣品制備、提取 DNA 的緩沖液選擇、標準品選擇和流式細胞檢測方法等方面進行歸納，總結出了植物細胞核 DNA 流式檢測的方法和技巧，可為植物科學研究者和從事流式細胞儀操作的技術人員提供參考。
1 植物細胞核 DNA 制備
1. 1 植物材料選擇
測試前對植物材料進行選擇和樣本制備是關系到流式細胞儀檢測細胞核 DNA 成功與否的關鍵，若檢測中樣本出現大量細胞碎片則會遮掩細胞核 DNA 信息，影響流式細胞儀檢測樣本細胞核的成峰效果和檢測結果的準確性。一般植物取材需要考慮樣品易獲性、細胞核型的穩定性和保存性等一系列問題。植物樣品最好選取新鮮的葉片或者幼嫩葉片，因其較易獲得合適的單細胞懸液，但也有研究者選取植物的根、莖等其它部位。例如，Dolezel 等[3]利用植物根尖分生組織制備染色體細胞懸液，對植物組織和細胞進行了 DNA 含量、倍性研究; Saito 等[5]利用流式細胞儀對萱草屬植物物種和栽培品種的葉、根、根狀莖、花梗進行了倍性分析，發現葉基部組織是最合適的材料。在野外采集中由于受條件限制，研究者經常采用濕濾紙包裹植物樣本并裝入密封塑料袋中置于冰盒保存，帶回實驗室后再置于-70℃冰箱中保鮮; 還有使用自然風干和快速干燥等方法保存樣品的。Suda 等[6]對新鮮、凍存、干燥的維管束植物樣本進行了流式細胞核 DNA 含量測定可行性的比較研究，發現利用維管束植物快速脫水干燥方法保存的樣品進行流式細胞核 DNA 測定是可行的，這使那些難以得到新鮮材料的稀有物種或不便及時處理的樣品也能夠利用流式細胞儀進行檢測成為了現實，促進了植物系統學、生態學和種群生物學的研究和發展。
1. 2 DNA 核解離液的選擇
流式細胞儀要求被檢測的植物樣本必須是完整的單細胞或細胞核懸液。在制備植物單細胞懸液時會產生大量的碎片，干擾細胞核 DNA 含量的檢測。目前還未發現能適合于所有物種的通用解離液。Loureiro 等[7]以蘆葦作為材料比較了 4 種解離液( Galbraith's /LB01 /OTTO/Tris·MgCl2 ) 的測 試效果，發現 LB01 和 OTTO 解離液的效果最好，且 OTTO 對一些 DNA 含量較低的物種也能得到較好結果。根據不同植物的組成特性，選擇合適的植物細胞核解離液將有助于細胞核的完全游離。如一些植物( 臭椿、擬南芥、獼猴桃等) 體內含有較高濃度的淀粉、多糖、磷酸鈣等新陳代謝類的黏性物質，為了消除酚類黏性物質的影響，在提取細胞核懸液時需加入體積濃度為 1%的聚乙烯吡咯烷酮 ( PVP) 。Li 等[8]采用 Hepes 緩沖液分析發現了迄今為止最高倍性( 10 倍體) 的獼猴桃。Chen 等[9]采用 WPB 緩沖液分析得到枸杞物種基因組的大小，枸杞果實含有許多胞漿化合物( 如酚酸類化合物和黃酮類化合物) ，會干擾細胞核 DNA 熒光染色，加入偏亞硫酸氫鈉和黏合劑 PVP-10 可以防止酚和次級代謝產物等的干擾。筆者參考國外文獻[10，11]并結合對來自深圳市仙湖植物園 120 份蕨類和苔蘚植物樣本的實驗發現，LB01 解離液比其它種類解離液更適合該類植物的細胞核裂解。表 1 中列出了實驗中常用的 8 種植物細胞核解離液及其配方，以供大家參考。
1. 3 參照樣本的選擇原則
流式細胞儀可以通過內標和外標法進行細胞核 DNA 含量測定。常規的倍性分析多采用外標法，而更精確的倍性分析建議采用內標法，如檢測異倍體。內標法可參照樣本已知的染色體倍性，推算測試樣品細胞核 DNA 的絕對含量，以避免因待測樣品的變異和機器工作狀態不穩定帶來的誤差。內標法的參照樣本應滿足以下條件: 參照樣本細胞核 DNA 含量已知且穩定，同目標樣本細胞核 DNA 含量相近; 參照樣本與目標樣本的基因組大小范圍相近; 標準樣本峰不能同目標樣本峰重疊，最好與目標樣本的 G2 或 M 期峰值不重疊。
目前在植物細胞核 DNA 含量的研究中仍采用雞血紅細胞用作植物材料的內參標準，雞血紅細胞來源多，測定結果穩定。如 Roux 等[12]以雞血紅細胞作為內參對照，用流式細胞儀檢測了香蕉細胞核 DNA 含量和染色體數目; Phivnil 等[13]用已知的大麥品種細胞核 DNA 含量作為對照鑒定了多個獼猴桃品種的倍性。常用參照樣本的倍性和細胞核 DNA 含量可見參考文獻[14，15]。
1. 4 熒光核酸染料的選擇
不同熒光探針的選擇對檢測植物細胞核 DNA 含量至關重要，細胞核染料主要分 2 種，特異標記和非特異標記染料。特異標記 DNA 熒光染料是非嵌入染色，主要與 DNA 的 A-T 堿基結合，忽略了 DNA 還有很多 G-C 堿基，會造成檢測基因組值偏小。因此最常用是非特異染料( 如 PI) ，但此方法操作時會使 DNA 和 RNA 也同時被染上色，需要降解 RNA 的干擾�，F將流式細胞儀常用熒光核酸染料及其檢測波長和特性列于表 2。
1. 5 植物樣本優化
制備好的植物樣品最好采用過濾方法和離心方法進一步去除細胞碎片和黏連細胞，這非常有利于流 式細胞儀上機檢測和成峰效果。Lee等[16]通過比較 PVP 設計的棉花濾管過濾法與尼龍網過濾法對提取液的過濾效果，結果顯示用棉花濾管過濾的提取液能夠去除多醣體，效果優于尼龍網; 于紅梅等[17]利用流式細胞儀檢測草莓染色體倍性時，以匍匐莖尖或根尖的細胞為材料，在常規提取液中添加巰基乙醇，采用細胞核 DNA 懸浮液離心漂洗 3 次后再經 300 目尼龍網過濾的方法，得到了理想的結果。裸子植物有較厚的角質層，細胞內次生代謝物質多，需要較長時間解離細胞核 DNA，比被子植物更難制備出完整的細胞核懸浮液。因此，制備的新鮮樣品如果當天檢測細胞核 DNA 的信號不佳，可將樣品放置冰箱避光 1～ 2 d 后再上機檢測，效果也許會更好。
2 流式細胞儀檢測植物樣本
2. 1 建立流式檢測的方案
植物種類繁多，染色體倍性復雜、多樣。植物細胞普遍存在內復制現象，往往以多倍體的形式存在，造成細胞核 DNA 含量的變化范圍較大，從 2C 到 16C，甚至到 128C，因此對這類植物多倍體宜采用動態范圍寬的對數形式。有些情況下植物細胞核 DNA 倍性變化范圍很窄，可以參照動物和人細胞動態范圍小的線性關系，則能更清楚地顯示不同物種間的變化。
本文來源于：《植物科學學報》Plant Science Journal(雙月刊)本刊主要刊載植物學及各分支學科的原始研究論文，植物學研究的新技術、新方法，綜合評述(應結合作者本人的研究工作、反映本學科在國內外的最新研究進展)、研究簡報、學術討論、重要書刊評介和學術動態等。
植物物種眾多，細胞大小差異較大，有些植物細胞較小，容易與碎片混淆。實際操作中，如果流式細胞儀的 FSC 閾值調得太高，細胞與碎片會被一起去掉，反之細胞與碎片則無法分開。我們的經驗是，首先根據植物細胞大小，確定植物細胞群位置，排除其它雜質、背景噪音的干擾，即確定合適前向散射光( FSC) 閾值; 其次是去除黏連細胞，其目的是避免假陽性結果，保證多倍體細胞與黏連細胞不被混淆。流式細胞儀去除黏連細胞的方案有許多，常規方法是根據細胞面積和寬度來設計去除黏連細胞。然而，在實際應用中也發現一些樣品的檢測效果不好，可換成采用側向散射光( SSC) 和 PI 熒光染料的通道去除黏連細胞以獲得較理想的結果，這主要是 SSC 參數能夠更好地反映細胞核聚集。因此，建立最佳流式細胞儀檢測方案、調節合適電壓也是流式細胞儀檢測植物細胞核 DNA 含量的關鍵步驟。
2. 2 應用實例
流式細胞術是一種簡單、快速、高通量檢測植物倍性水平、種內雜交、單性生殖，以及基因組的大小、多倍體和性染色體的方法。Cousin 等[18]在 6 h 內對 192 例蕓苔屬植 物 采 用 96 孔 板 BeadBeating 制備方法，通過流式細胞儀進行了細胞核 DNA 含量測定，摸索出大規模高通量檢測的方法，且保證了數據和樣品的可重復性，是非常值得借鑒的一種制備植物樣品的方法。Dolezel 等[19]通過比較 4 個實驗室不同的操作人員、不同方法、不同儀器估計細胞核 DNA 基因組的大小，結果顯示各實驗室間差異較小; 使用 Galbraith buffer 和 PI 能夠測定大多數植物種類的絕對基因組大小，PI 比 DAPI 更可靠、更適合用于評估植物基因組的大小; 當基因組差異較小時，應該在同一實驗室使用相同的儀器來消除系統性誤差。在長期實驗過程中我們發現制備植物細胞核 DNA 樣本最關鍵的是選擇合適的細胞核解離液。采用煙草和油菜為材料對 8 種 DNA 緩沖液進行比較，我們發現 Hepes 緩沖液適合于大多數植物，變異系數最小; 其次是 Tris· MgCl2和 LB01( 圖 1) 。對于倍性相對復雜的植物，因倍性越高，變異系數也越大，應選擇與之相近的物種標準品作內參，以避免或減小誤差。筆者在此將本實驗室近期使用流式細胞儀( BD 公司，AriaⅢ 型) 檢測植物細胞核 DNA 含量樣本的使用方法歸納列于表 3，供大家參考。
總之，針對不同植物種類需要根據物種特性采用不同的制備細胞核 DNA 方法。我們也將在今后的實驗中不斷地探索，以期總結出更好的方法。——論文作者：汪 艷* ，肖 媛，劉 偉，李婷婷，胡 銳，喬志仙
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