發布時間：2021-10-15所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要在自然界，角是野生動物抵御天敵、爭奪配偶的工具，但在規�；B殖中，天生無角是有利性狀，可減少管理成本和保護動物福利。牛(Bostaurus)無角性狀呈常染色體顯性遺傳，具有多等位基因特點，目前已知有3類不同來源的無角等位基因(奶牛:Friesian;肉牛、乳
摘要在自然界，角是野生動物抵御天敵、爭奪配偶的工具，但在規�；B殖中，天生無角是有利性狀，可減少管理成本和保護動物福利。牛(Bostaurus)無角性狀呈常染色體顯性遺傳，具有多等位基因特點，目前已知有3類不同來源的無角等位基因(奶牛:Friesian;肉牛、乳肉兼用牛:Celtic;蒙古牛:Mongolian)。為了開發準確高效的牛無角基因分子檢測方法，研究基于整合競爭性等位基因特異性PCR(kompetitiveallele-specificPCR,KASP)和微流控芯片技術的檢測平臺，根據3種不同類型的結構變異設計特異性引物，建立了針對3種牛無角基因的快速診斷方法。通過對采自國內外不同牛品種的樣本檢測，并與PCR擴增測序和凝膠電泳等傳統檢測方法的結果相對比，證明新方法可以對3種無角基因準確分型，適于規�；瘷z測應用。此外，本研究首次在我國三河牛品種中鑒定出Mongolian無角等位基因，同時在Friesian無角等位基因序列中新發現一個2bp缺失，可作為無角基因特異標記。研究結果為開展無角牛的分子選育提供了技術手段。
關鍵詞競爭性等位基因特異性PCR(KASP);無角基因;三河牛;分子檢測;微流控芯片
在自然界中，牛角是抵御天敵、爭奪配偶的工具(Robinsonetal.,2006;Johnstonetal.,2013);而在集約規�；B殖條件下，角的存在不僅給動物間帶來互相傷害，也給飼養管理人員帶來安全威脅，故天生無角是牛人工養殖生產中的有利性狀。牛的無角性狀遺傳方式為常染色體顯性遺傳，具有多等位基因的特點，目前已知在普通牛(Bostaurus)中有3類不同來源的無角基因：Celtic等位基因(Medu‐goracetal.,2012)，存在于以安格斯牛、西門塔爾牛等肉牛或乳肉兼用牛品種中，遺傳機制是1號染色體內的一段212bp序列的重復，代替了長度為10bp的序列;Mongolian等位基因(Medugoracetal.,2017)，發現于蒙古牛中，遺傳機制是1號染色體一個219bp的插入;Friesian等位基因(Medugoracetal.,2012)，存在于以荷斯坦牛、娟姍牛為代表的奶牛品種中，遺傳機制是1號染色體上一個80kb片段的重復。
開發靈敏、準確的牛無角基因的檢測方法，鑒定不同無角基因的基因型，對于培育無角牛具有重要應用價值。目前國外研究者已報道了幾種傳統的分子檢測技術，例如PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳(Celtic,Mongolian,Friesian)(Medugoracetal.,2012;Medugoracetal.,2017;Wiedemaretal.,2014)、PCR擴增產物毛細管電泳(Celtic,Friesian)(Wiedemaretal.,2014;Medugoracetal.,2012)、Sanger測序(Frie‐sian)(Wiedemaretal.,2014)。但這些檢測方法存在明顯缺陷：1)沒有統一的檢測技術能夠同時對3種無角等位基因進行分型;2)瓊脂糖凝膠電泳、Sanger測序等傳統檢測方法，操作步驟多、耗時長，無法實現快速檢測;3)針對Friesian無角基因，已報道的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測，只能判斷是否攜帶無角基因，無法區分無角等位基因的雜合子和純合子，未達到精確分型的效果。競爭性等位基因特異性PCR(kompetitiveallele-specificPCR,KASP)是近年來新出現的一種DNA變異分型技術，基于競爭性等位基因特異性PCR原理，具有準確、靈活、成本低的特點(Heetal.,2014)，對SNP、Indel及大片段缺失插入等不同變異類型均可檢測(Zhangetal.,2020)。本研究基于KASP和微流控芯片技術的檢測平臺，開發針對3種牛無角基因的快速診斷方法，以適于規�；瘷z測應用。
1材料與方法
1.1樣本及基因組DNA提取
樣本采自不同品種普通牛(Bostaurus)共39頭，其中奶牛9頭，品種為荷斯坦牛和娟姍牛;肉牛和兼用牛17頭，品種包括安格斯牛、西門塔爾牛(樣本來源于德國和美國)、夏洛萊牛和利木贊牛;我國地方品種(三河牛、秦川牛和蒙古牛)牛12頭。這些樣本都具有表型信息，除秦川牛、蒙古牛樣本為血液，其余樣本均為冷凍精液。
利用試劑盒(基因組DNA提取試劑盒DP304，北京天根生化科技有限公司)提取血液樣本DNA。利用高鹽法提取牛凍精基因組DNA，具體步驟如下：1)將凍精置于2mL離心管中，加入500μL生理鹽水，渦旋混勻，12000r/min離心1min，倒去上清液保留沉淀。該步驟重復1次。2)向沉淀中加入400μL二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)裂解液、100μL20%的十二烷基硫酸鈉溶液(sodiumdodecylsulfate,SDS)，放置一段時間后渦旋，使之完全溶解，再加入10μL蛋白酶K，顛倒混勻。隨后將樣品置于56℃水浴鍋中消化20~22h。3)取消化好的樣品，加入300μL飽和食鹽水，顛倒2~3min，放入4℃冰箱靜置一會，隨后在4℃下12000r/min離心10min，將上清液轉移至新離心管中。4)離心管中加入1000μL無水乙醇，顛倒1~2min，12000r/min離心2min，倒去上清液保留DNA沉淀。5)裝有DNA沉淀的離心管中加入500μL75%的乙醇，顛倒混勻，12000r/min離心2min，倒去上清液保留DNA沉淀。該步驟重復1次后，開蓋放置使乙醇完全揮發。6)離心管中加入100μL56℃的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液，4℃過夜，沉淀溶解。
最后利用ThermoScientificNanoDrop2000對基因組DNA質量、濃度進行檢測。
1.2基于整合KASP和微流控芯片技術的無角基因檢測
SNP分型采用基于微流控芯片的SNP檢測系統(iMAP,北京博奧晶典生物技術有限公司)，其原理是在微流控芯片上完成基于等位基因特異擴增原理的KASP分型。所用微流控芯片大小為75mm×25mm×2mm，具有112個反應孔，分布于4排，每排28個孔，每個反應孔體積1μL。除去預留作為對照的16個空白孔位(4個/排×4排)，該系統可以在2.5h內實現對96個樣本(24個/排×4排)的分型檢測(Luetal.,2019)。
1.2.1特異性引物設計
根據3種無角等位基因的序列特征設計KASP特異性引物(表1)。
Celtic等位基因是牛1號染色體上1705834~1706045bp(牛UMD3.1版本參考基因組，下同)之間一段212bp序列發生重復，該重復代替了一段位于1706051~1706060bp長度為10bp的序列，該位點表示為P202ID(Medugoracetal.,2012)。本研究根據P202ID重復序列末端的堿基差異性設計引物(圖1B)。
Mongolian等位基因有兩個特異性突變位點，一是在1975461~1975487bp處存在1bp的缺失(CTGAATC被替換為TCTGAA)，表示為P1ID;二是在1976128bp處存在一個219bp的插入，表示為P219ID(Medugoracetal.,2017)。本研究針對P1ID設計引物(圖1C)。
Friesian等位基因存在5個緊密連鎖的候選突變位點，其中3個是單核苷酸多態(SNP)，分別為：1654405bp處G→A(PG1654405A);1655463bp處C→T(PC1655463T);1768587bp處C→A(PC1768587A)。另外2個為插入缺失(InDel)，即在1649163~1649169bp處有一段5bp的InDel(P5ID)、在1909352~1989480bp后存在一段長度為80128bp的串聯重復(P80kbID)，該串聯重復內部還存在一個SNP(1909354:T→A)和一個2bp的缺失(1909396D2:TG)(Medugoracetal.,2012)。本研究針對此2bp缺失和PC1768587A分別設計了1組特異性引物(圖1A)。
每個引物組合含3條引物，包括上游引物2條和下游引物1條，其中2條上游引物是根據位點等位基因序列差異而設計的，在KASP擴增過程中分別加上不同的熒光基團，即羧基熒光素(FAM,car‐boxyfluorescein)和六氯熒光素(HEX,hexachlorofluorescein)，最后根據PCR產物熒光信號進行基因型分型。引物由北京博奧晶典生物技術有限公司合成。
1.2.2競爭性等位基因PCR(KASP)
表1中的4組引物，每組引物與模板DNA、PCR預混液以及雙蒸水組成一個PCR反應體系，共組成4個PCR反應體系，每個PCR反應體系的體積為1μL。每個PCR反應體系中包括引物混合液0.14μL，PCR預混液(2×universalKASPMasterMix,LGC)0.50μL，DNA模板5~10ng，雙蒸水補齊到總體積1μL。其中引物混合液中2條等位基因特異性引物濃度均為12µmol/L，下游通用引物濃度30µmol/L。上述4個PCR反應體系可同時在微流控芯片(北京博奧晶典生物技術有限公司,產品編號G020010)上進行擴增反應，擴增程序均為：95℃變性15min，之后為降落PCR(touchdownPCR)擴增10個循環，變性溫度95℃，退火溫度在10個循環中從61℃降落到55℃，每個循環變性20s、延伸60s;然后為常規PCR擴增26個循環，變性溫度95℃，退火溫度55℃，每個循環變性20s、延伸60s;最后37℃延伸60s。
PCR反應完成之后，利用熒光信號掃描儀(北京博奧晶典生物技術有限公司，產品型號LuxScan10K/D)進行掃描，生成圖像文件，通過軟件轉換成數據信號值，根據熒光信號的散點圖判定基因型。
1.3KASP分型結果驗證實驗
1.3.1引物合成
利用Primer3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)在線設計軟件，根據牛參考基因組(Bostauru⁃sUMD3.1;GenBank登錄號GCA_000003055.5)核苷酸序列，對P80kbID位點分別設計出一條正向和反向引物。其他位點P202ID(Medugoracetal.,2012)，PC1768587A(Wiedemaretal.,2014)，P219ID(Medugoracetal.,2017)引物序列來自文獻報道(表2)。引物由擎科新業生物技術有限公司合成。
1.3.2目標序列的擴增與凝膠電泳測序
以樣本基因組DNA為模板進行目標序列的擴增。PCR反應體系總體積25µL，其中10×Buffer2.5µL，dNTP混合物(各2.5mmol/L)2µL，Taq酶(5U/µL)0.5µL，上下游引物(20µmol/L)各0.5µL，基因組DNA模板1µL(約50ng)。PCR反應條件：94℃預變性5min;然后35個循環，94℃變性30s，在引物對應的退火溫度下復性30s，72℃延伸30s;最后72℃延伸7min。整個擴增反應在AppliedBiosystems9700型PCR儀內完成。
P219ID、P80kbID和P202ID位點的PCR產物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測分型。制作濃度為2%的瓊脂糖凝膠，取每個樣品的PCR產物4µL點樣，在TAE緩沖液中110V電壓下電泳20min，在凝膠成像系統中觀察電泳結果。PC1768587A位點采用PCR產物直接Sanger測序分型。
2結果與分析
2.1KASP檢測結果
利用KASP方法對所有39個樣本將3種不同類型無角基因同時進行檢測，Celtic無角基因P202ID位點分型散點圖如圖2A所示，檢測到8個無角純合子，6個無角雜合子;Mongolian無角基因P1ID位點分型散點圖如圖2B所示，檢測到1個無角雜合子;Friesian無角基因P80kbID、PC1768587A位點分型散點圖分別如圖2C、圖2D所示，聯合檢測到9個無角突變個體，其中包括1個純合子和8個雜合子。
2.2Friesian無角基因序列分析
針對Friesian無角基因，本研究起初設計基于P80kbID位點的分型方法，但檢測結果顯示，該位點雖然能檢測出有無Friesian無角基因，但無法確定是純合子和還是雜合子。經Sanger測序發現，野生型序列(圖3A)與突變型(圖3B)的第一個80kb拷貝序列在P80kbID位點的基因型完全一致，因此即使是突變型純合子，也會產生與野生型等位基因的檢測信號。為解決此難題，我們引入另外一個與Friesian無角基因關聯的突變位點(PC1768587A)，用于輔助判定無角基因的純合子或雜合子，檢測結果”CA”為無角雜合子，”AA”為無角純合子。與此同時，在對Friesian無角基因進行Sanger測序時發現，在第2個80kb的串聯重復的起始處有一個長度為2bp的缺失(AG)(圖3C;3D)。
2.3驗證實驗結果
利用PCR擴增和凝膠電泳實驗以及Sanger測序對KASP檢測結果進行驗證。Celtic無角基因P202ID位點檢測結果如圖4A所示，其中長度為345bp的條帶對應野生型，長度為547bp的條帶對應無角純合子，雙條帶對應無角雜合子。在17個肉�；蛉槿饧嬗门悠分�，共有8個Celtic無角基因純合子、6個雜合子和3個野生型。對Mongolian無角基因P219ID位點檢測結果如圖4B所示，其中長度為895bp的條帶對應野生型，雙條帶對應無角雜合子。在包括蒙古牛、秦川牛和三河牛在內的13個樣品中，僅有1個三河牛樣本基因型為無角雜合，其余全為野生型。Friesian無角基因P80kbID位點檢測結果如圖4C所示，其中長度為300bp的條帶對應突變型，無條帶泳道對應野生型。在包括荷斯坦牛和娟姍牛在內的9個奶牛樣本中，有6個突變型，3個野生型。利用PC1768587A位點對Friesian無角基因進行基因分型，在6個突變型中，有5個無角雜合子(圖4D,左)，1個無角純合子(圖4D,右)。
相關期刊推薦：《農業生物技術學報》(JournalofAgriculturalBiotechnology)(月刊)1993年創刊，由農業部主管，中國農業大學、中國農業生物技術學會、原農業部科技司共同主辦，中國農業大學農業生物技術國家重點實驗室承辦。是我國農業生物技術領域唯一的學術期刊。它反映我國農業生物技術領域最新的科研成果，促進國內外學術交流。
將兩種檢測結果匯總后進行對比(表3)，對KASP檢測結果進行評估。結果表明，KASP的檢出率為100%，并且分型結果與分子實驗結果完全一致。
3討論
KASP是一種新型的SNP分型方法，具有快速、準確、靈活性高等優勢(Heetal.,2014;Zhangetal.,2020)，在不同領域得到廣泛應用。有報道利用KASP技術對兒童遺傳性耳聾進行檢測(Luetal.,2019)，Rasheed等(2016)對影響小麥重要經濟性狀的功能基因進行檢測，對小麥適應性、產量和品質等進行篩選，以實現遺傳改良(Semagnetal.,2014)。Zhang等(2020)設計荷斯坦奶牛常見的8種遺傳缺陷的檢測方法。KASP分型技術的關鍵在于引物設計，本研究選取無角基因的特異性位點，包括Celtic無角基因位點P202ID，Mongolian無角基因位點P1ID成功設計了分型引物。但針對Friesian無角基因，本研究起初設計基于P80kbID位點的分型方法，但初步檢測顯示，P80kbID能檢測出有無Friesian無角基因，但無法確定是純合子和還是雜合子，原因是經Sanger測序發現，野生型序列與突變型的第一個拷貝序列在P80kbID位點的基因型完全一致。故我們引入另外一個與Friesian無角基因密切關聯的突變位點(PC1768587A)，用于輔助判定無角基因的純合子或雜合子，實現Frie‐sian無角基因準確分型。為了提高檢測效率，本研究使用了整合KASP與微流控芯片的檢測技術(Luetal.,2019)，使點樣、反應、分型等基本操作單元集成到一塊75mm×25mm×2mm的芯片上，自動完成分析過程，該技術適用于無角基因大規模檢測。
本研究對蒙古牛、秦川牛和三河牛等中國黃牛品種的無角基因進行鑒定，首次在三河牛中檢測到Mongolian基因P1ID位點的存在。Mongolian基因最早由Medugorac等(2017)利用76頭牛基因組測序數據，從蒙古國的蒙古牛(MongolianTuranocattle)上發現的，該無角基因在我國地方牛品種的分布還沒有報道。三河牛主要分布在我國內蒙古額爾古納右旗三河地區，是我國培育的第一個乳肉兼用品種。該品種為西門塔爾牛、西伯利亞牛和俄國改良牛(如后貝加爾土種牛、塔吉爾牛等)與當地蒙古牛經過長期雜交后選育而成(吳宏軍等,2012)，故我們推測三河牛中無角基因很可能來自于蒙古牛。
Friesian基因共有5個候選突變，本研究中選擇P80kbID和PC1768587A兩個位點設計特異性引物利用KASP進行檢測。此前有報道表明P80kbID為Friesian基因最可能的致因突變，而PC1768587A和P80kbID高度連鎖，從表3檢測結果可知檢出率和準確率均為100%，證明了突變位點的檢測準確性。值得注意的是，本研究所檢測的2個德國西門塔爾牛樣本(編號6、8)內，既檢測到P202ID位點，也檢測到PC1768587A和P80kbID這兩個位點。進一步對這兩個樣本進行PCR擴增和Sanger測序后，結果與KASP一致。說明這2個樣本同時攜帶Celtic、Friesian兩種不同無角等位基因。有研究表明(Schafberg等,2015)，人類對無角牛特殊的培育歷史使得Friesian和Celtic無角基因逐漸開始滲透。Wiedemar等(2014)也發現Friesian基因也存在于少數西門塔爾牛中，而Celtic基因也存在于少數荷斯坦奶牛。Allais等(2013)和Rothammer等(2014)的研究結果也驗證了這一觀點。本研究所開發的KASP檢測方法的優勢在于對多個無角基因位點可同時進行檢測，達到準確分型的效果。
此外，本研究在對Friesian基因P80kbID位點內兩個串聯重復進行Sanger測序時發現，在第2個80kb的串聯重復開始有一個長度為2bp的缺失(AG),此前研究未報道該缺失的存在，屬首次發現。該分子標記可以用于設計新的特異引物，進一步優化Friesian基因的檢測方法。
4結論
本研究利用競爭性等位基因特異性PCR(KASP)技術開發了3種類型無角基因的聯合分子檢測方法。與常規分子實驗技術相比，該方法能夠實現無角基因的高效、快速、準確檢測;在中國本地牛品種中首次鑒定發現Mongolian無角基因，為無角黃牛的選育奠定了分子遺傳基礎;在Friesian無角基因內發現一個此前未報道的2bp缺失位點，為今后優化檢測方法提供了可能。——論文作者：顏澤1肖煒2張勝利1王雅春1張毅1*
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