發布時間：2021-09-06所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：為了解P限制水體中浮游植物群落對N、P營養鹽的響應，通過添加N、P營養鹽設置N/P梯度，對廣東省流溪河水庫中的浮游植物群落進行了研究。結果表明，添加N、P顯著促進浮游植物的生長，浮游植物群落受P鹽的影響比N鹽顯著;藻類的種屬特異性導致浮游植物群落
摘要：為了解P限制水體中浮游植物群落對N、P營養鹽的響應，通過添加N、P營養鹽設置N/P梯度，對廣東省流溪河水庫中的浮游植物群落進行了研究。結果表明，添加N、P顯著促進浮游植物的生長，浮游植物群落受P鹽的影響比N鹽顯著;藻類的種屬特異性導致浮游植物群落對氮磷營養鹽的響應不一致，浮游植物總豐度與N/P比值不相關，其中隱球藻(Aphanocapsasp.)、擬柱胞藻(Cylindrospermopsisraciborskii)和假魚腥藻(Pseudanabaenasp.)等藍藻適合在高N高P條件下生長,雙對柵藻(Scenedesmusbijuga)等綠藻優勢種偏好中N高P環境，而曲殼藻(Achnanthessp.)、小環藻(Cyclotellasp.)等硅藻在低N低P的環境下占據優勢;P濃度為0.8~2.0µmol/L時存在誘導浮游植物堿性磷酸酶活性的閾值，當P濃度大于2.0µmol/L時則抑制酶活性;P濃度為2.0µmol/L可能是浮游植物維持生長的最適濃度，浮游植物N/P維持動態平衡;藻細胞N/P、C/P與水體P濃度、N/P呈顯著正相關，而藻細胞C/N受N影響更明顯(P<0.05)。這為熱帶亞熱帶水庫的水質管理提供了理論參考。
關鍵詞：浮游植物群落;氮磷比;堿性磷酸酶;藻;元素
Redfield比值[1]是指養分不受限制時，藻類健康生長和生理平衡的元素比值關系為C/N/P=106/16/1。然而，許多研究[2–3]表明，有機體的化學計量C/N/P比值在不同的環境中存在差異。N和P是浮游植物生長所必需的營養元素，不僅絕對濃度能夠影響藻類的生長，其比率(N/P)也直接影響藻類生長、細胞組成及其對營養的攝取效率。宋玉芝等[4]報道N/P為25時浮游藻類及附著植物的生物量隨水體N濃度的升高而顯著增加;Stockner等[5]報道，N/P比值從15提高到25時水體中的優勢種從魚腥藻(Anabaenasp.)逐漸發展為聚球藻(Synechococcussp.);純種或混合培養體系中，N/P比不僅影響藻類的最大現存量，還影響藻類種間競爭的抑制參數、比生長速率等[6–7]。研究表明，在一定范圍內，N/P的降低有利于甲藻占優勢，高N/P(256/1)則對硅藻生長有明顯促進作用[8]，而藍藻水華更容易出現在低N/P下的超富營養水庫中[9–10]。因此水體N、P供應及其比率影響著浮游植物種間競爭，對浮游植物群落的結構和演替有重要的決定作用[11]。
廣東省地處熱帶亞熱帶北沿，區域季節性降雨較充足，水體常年溫度較高，輻射較強，有助于浮游植物的全年生長，同時也提高了浮游植物對營養鹽的需求[12]。然而，熱帶亞熱帶水庫中磷酸鹽長期維持在低濃度水平，P成為浮游植物生長的限制因子[13–15]。浮游植物在生長繁殖過程中可以通過調整其化學計量比(C/N/P)來改變生長速率，從而適應營養鹽限制環境[16–17]，還能通過分泌胞內外堿性磷酸酶，通過裂解水體中的有機磷為無機磷[18],供自身生長所需;此外，一些水華藻類如擬柱胞藻[19]對低磷環境有著特殊的適應機制，能超額富集水體中較低濃度的P，這些特性使得這些水華藍藻能夠在P限制的水體中大量生長。本研究選取了一座典型低磷水平的南亞熱帶水庫，其全年水體的平均N/P比接近90/1[20]，通過氮磷營養鹽的添加試驗來探究自然磷限制水體中浮游植物群落對不同氮磷比營養鹽的響應。本研究從群落水平研究了營養鹽的相對濃度對浮游植物的影響，為廣東省熱帶亞熱帶水庫的湖沼學研究和水質管理提供理論參考。
1材料和方法
1.1試驗藻種來源和試驗設計
2019年2月20日于廣東省流溪河
水庫取表層原水，經60µm濾網過濾浮游動物以及懸浮大顆粒物后，置于容量桶中帶回實驗室，測定原水的溶解態N濃度、溶解態P濃度、堿性磷酸酶活性(APA)、藻細胞C、N、P等指標作為初始值;原水為試驗培養用水，原水中的浮游植物即為試驗浮游植物群落的來源。取搖晃均勻的原水400mL分裝于T175細胞培養瓶(TC-FlascheT175，Stand，Vent.Cap),為避免其他營養元素限制，事先已加入無N、P的WC培養基[21]。
基于經典的Redfield比值，即N/P比為16的閾值，我們認為該水庫浮游植物主要受到P鹽的限制，N鹽十分充足。處理組N/P濃度的設置中N最低為原水本身的濃度，即N1濃度(41.1µmol/L)，N絕對濃度以20µmol/L為梯度增加，而P最低是高于原水的P3濃度(0.8µmol/L)，P絕對濃度以1.2µmol/L為梯度增加，共設計9組N/P處理組,1組空白對照(表1)。每組設3個平行,試驗期間不再添加營養元素。培養條件：溫度為(25±1)℃、光周期為12h/12h、光照強度為40µmol/(m2·s)，每天定時搖動藻液1次，隨機移動藻瓶位置，避免光照不均勻。
1.2生長時期確定
隔天搖勻藻液，并移取于離心管中，用分光光度計在680nm波長下測定OD值，以天數為橫坐標、OD值為縱坐標繪制浮游植物生長曲線來確定浮游植物生長時期，最終確定試驗開始的第1天為初始期,第13天為指數期，第21天為穩定期。
1.3藻細胞胞內C、N、P含量測定
藻液過濾到酸化預處理后的玻璃纖維濾膜(WhatmanGF/C，孔徑1.2μm)上，烘干儲存于干燥器中。使用元素分析儀(型號VarioEL)進行C、N含量分析;藻細胞P含量采用鉬酸銨分光光度法(GB11893-89)。
1.4堿性磷酸酶活性的測定
采用對硝基磷酸苯二鈉法[22]測定水樣堿性磷酸酶活性(APA)，反應條件為pH8.4、溫度35℃、反應體積2mL、反應時間4h、測量波長410nm。依據對硝基苯酚的標準曲線，計算水解反應產生的對硝基苯酚的量。計算公式：APA=C/(T×V),式中，APA為堿性磷酸酶活性[nmol/(L·min)];C為對硝基苯酚的變化量(nmol)，即水解反應的產生對硝基苯酚量;T為水解反應的時間(min);V為測試水樣的體積(L)。
相關期刊推薦：《熱帶亞熱帶植物學報》JournalofTropicalandSubtropicalBotany(雙月刊)1992年創刊，優先報道熱帶亞熱帶地區植物學、生態學、環境科學及其交叉學科領域中的新發現、新理論、新方法和新技術,亦歡迎來自不同氣候帶的植物科學研究論文，重點刊登全球氣候變化及生態系統服務功能、系統與進化生物學、環境退化與生態恢復、生物多樣性保育及可持續利用、農業及食品質量安全與植物化學資源、植物種質創新與基因發掘利用以及能源植物的開發利用等方面的新成果。
水樣不經過過濾測定的酶活性值為總的堿性磷酸酶活性(TAPA)，經WhatmanGF/C濾膜(孔徑1.2μm)過濾后測定的酶活值為細菌+溶解性堿性磷酸酶活性(BAPA+DAPA)，則浮游植物的堿性磷酸酶活性為PAPA=TAPA-(BAPA+DAPA)。為校正因生物量的增加引起的總體活性增長，PAPA與生物量指標的比值即浮游植物單位生物量所表現的酶活性，也稱作酶的特異性活性(specificactivity)，能更好地反映酶的內在催化效力[23]。本試驗中，單位生物量酶活性(單位生物量APA)=PAPA/藻類總生物量，以nmol/(min·mg)表示。
1.5浮游植物的種類和定量分析采用Utermöhl計數法于倒置顯微鏡下對浮游植物進行分類鑒定和計數[24]，每個樣品分別鏡檢多于400個浮游植物個體，其豐度計算公式為：N=(C×D2)/(V×n×d),式中，N為藻細胞豐度(cells/L)，V為沉降水樣的體積(L)，D為載玻片直徑(mm)，d為計數鏡頭直徑(mm)，n為計數鏡頭數，C為計數細胞數(cells)。浮游植物種類鑒定主要參照《中國淡水藻類——系統、分類及生態》[25]和有關文獻。根據浮游植物形態和大小計算各種浮游植物對應的生物量，本文選擇粗分法進行生物量計算[26]。
1.6數據處理
運用IBMSPSSStatistics22S統計軟件對數據進行顯著性分析(One-WayANONA)，采用LSD法進行驗后比較，差異顯著性水平設為α=0.05，兩個變量之間進行Pearson相關性分析。
2結果和分析
2.1浮游植物群落的組成
試驗共觀察到浮游植物6門72種(屬)，其中綠藻門47種(屬)、硅藻門10種(屬)、藍藻門9種(屬)、甲藻門2種(屬)、金藻門2種(屬)、隱藻門2種(屬)，浮游植物群落主要以藍藻、綠藻和硅藻為主。原水浮游植物群落經培養后發生了變化(圖1)。初始期原水中的浮游植物較少，總豐度為1.11×106cells/L,優勢類群為硅藻門，占51.50%，其次為藍藻門31.60%;指數期，浮游植物總豐度下降到0.89×106cells/L,而穩定期總豐度上升為1.23×106cells/L。指數期和穩定期群落主要以綠藻、硅藻為主，在穩定期金藻豐度明顯上升。原水浮游植物總豐度先降低后升高，逐漸由硅、藍藻轉變為綠、硅藻為優勢的群落結構。
添加N、P營養鹽后，浮游植物總豐度均顯著上升(圖2)。指數期，浮游植物總豐度為2.93×107~1.22×108cells/L，以N2P1處理的豐度最高、N2P3的最低;在N1水平下，不同P濃度的浮游植物總豐度差異不大，而在N2、N3水平下，P1的總豐度顯著高于P2，稍高于P3，表明N、P鹽越高，浮游植物的生長越快。穩定期，浮游植物總豐度為3.33×107~1.19×108cells/L，N3P2處理的豐度最高，N2P2的最低，且大多組比指數期有明顯上升，而N2P1、N2P2和N3P1總豐度降低，這可能是營養鹽濃度較高促進浮游植物迅速生長，提前進入了衰亡期，導致豐度出現下降。Pearson相關分析表明，指數期、穩定期浮游植物總豐度與N/P比值的相關性不顯著(P>0.05)。
不同營養條件下，浮游植物豐度組成有明顯差異(圖2)。指數期，在N1水平下，藍、綠藻占比為P1>P2>P3，硅藻占比則相反，藍、綠藻優勢隨P的增加更為明顯;在N2水平下，藍藻占比以P1>P2>P3，硅藻占比則相反，綠藻占比P2、P3均大于N1、N3水平下的P2、P3，表明相比于低、高N環境，中N水平下綠藻優勢更大;在N3水平下,綠藻占比以P1>P2>P3，硅藻占比以P2>P3>P1,藍藻占比均高于N1、N2水平的同P水平。穩定期,相同N水平下綠藻占比均為P1>P2>P3，硅藻占比則相反，而藍藻在N3水平下均高于N1、N2水平下的各處理，與指數期一樣，表明藍藻在高N條件下的優勢，而綠藻在高P下占比更大。
不同時期的藍藻、綠藻和硅藻豐度存在差異(圖3)。指數期時，同一N水平下，P1的藍藻豐度明顯高于P2、P3;同一P水平下，N3的藍藻豐度高于N1、N2，但N2P1的豐度最高，這可能是誤差造成的;同一N水平下，綠藻豐度以P1>P2>P3，同一P水平下，N2的綠藻豐度最高;N1水平下,硅藻豐度以P3>P2>P1，在N2、N3水平下則相反。穩定期時，不同N/P下藻類的豐度變化與指數期有差異，進入衰亡期的時間不同。綜合可知，藍藻在高N、P下的優勢更明顯，而綠藻在中N高P下生長更好;N、P濃度的升高，均能促進硅藻的生長,但優勢上沒有藍、綠藻明顯。
2.2浮游植物優勢種的變化
不同營養條件下浮游植物優勢種不同(圖4)。指數期時，對照組優勢種為小環藻，其次是微小四角藻(Teraëdronminimum)和錐囊藻(Dinobryonsp.);而處理組的優勢種主要為曲殼藻、隱球藻和雙對柵藻，在N1、N2水平下，曲殼藻占比以P3>P2>P1,在P2、P3為第1優勢種，而P1的隱球藻占比超過曲殼藻成為第1優勢種，小環藻遠不及曲殼藻，雙對柵藻則在N2水平有一定優勢;在N3水平，P1和P3的第1優勢種分別為假魚腥藻和隱球藻，而P2的第1優勢種為曲殼藻，其次為鐮形纖維藻(Anki-strodesmusfalcatus)。穩定期時，對照組第1優勢種為小環藻，其次為曲殼藻、錐囊藻;處理組的主要優勢種為曲殼藻、假魚腥藻和擬柱胞藻。曲殼藻占比與指數期相比有所上升，均呈P3>P2>P1，并以N2P3為最大，N1水平下曲殼藻均為第1優勢種,在N2P3、N3P3下為第1優勢種;N2水平下P1和P2的第1優勢種分別為擬柱胞藻、假魚腥藻，N3水平下第1優勢種主要為假魚腥藻，占比大于曲殼藻。
2.3浮游植物堿性磷酸酶活性的變化
原水中浮游植物在初始期具有較高的堿性磷酸酶活性(APA)，為2.17nmol/(min·mg)，到指數期和穩定期顯著上升，分別為32.42和146.38nmol/(min·mg),且顯著高于同時期處理組。指數期時，同一N水平下，P1和P2的APA明顯低于P3，也低于初始期;穩定期時，同一N水平下，P3的APA高于P1和P2，而同一P水平下，N1的APA低于N2和N3。方差分析表明，APA與P濃度和N/P有顯著相關性(P<0.05)，指數期APA與N/P的正線性相關較差，線性方程為y=0.0355x+0.5372(R2=0.3488)，穩定期兩者的正線性相關極高，線性方程為y=0.3719x5.3566(R2=0.8901)(表2)。
2.4浮游植物元素化學計量值變化
初始期，浮游植物藻細胞的N/P、C/N和C/P分別為45±4、5±1和256±36，指數期與穩定期的細胞元素比值發生了明顯變化(表3)。指數期，對照組藻細胞N/P和C/P均顯著高于處理組，而藻細胞的C/N顯著低于處理組;同一N水平下，藻細胞的N/P顯示P3組>P2組>P1組，各處理間的差異顯著(P<0.05);藻細胞的C/P在P3顯著大于P2和P1，且P1與P2的差異不顯著(P>0.05);同一P水平下，藻細胞C/N在N1顯著大于N2和N3，N2與N3間差異不顯著(P>0.05)。對浮游植物藻細胞元素計量值與N/P比值進行線性擬合(表2)，表明指數期的藻細胞N/P、C/P和C/N與水體N/P比值相關性不明顯。
穩定期，對照藻細胞N/P顯著高于各處理組,藻細胞C/N低于各處理組，而藻細胞C/P顯著高于處理組中的所有P1、P2組，而低于P3組;同一N水平下，藻細胞N/P在P3組均顯著大于P2、P1組,P1組與P2組差異不顯著(P>0.05);不同處理組之間的藻細胞C/N差異不顯著，均值為10±1。穩定期浮游植物元素各比值與N/P擬合線性相關,藻細胞N/P、C/P與N/P比值的正線性相關強，而藻細胞C/N與N/P比值不相關(R2=0.0016)。
試驗中藻細胞C/N為4~15，較C/P的變化范圍小，在Redfield值(6.6)附近變化;藻細胞C/P在穩定期差異較大，與P處理濃度表現出線性相關。指數期藻細胞N/P為7.65~26.85，穩定期為7.37~37.83。細胞內元素的組成對不同N和P處理水平的響應不同,藻細胞N/P、C/P均受P和N/P影響顯著(P<0.01)，而藻細胞C/N受N處理影響更明顯;在指數期，N和P處理的絕對濃度僅對細胞內N和P含量有顯著的影響(P<0.01);在穩定期，N水平的絕對濃度對細胞元素含量沒有顯著影響，P處理的絕對濃度對細胞C、N和P的含量均有顯著影響(P<0.01)(表4)。
3結論和討論
3.1浮游植物群落結構對營養鹽濃度的響應
南亞熱帶水庫大多數為貧中營養型水體。在枯水期(11月-次年3月)，水體滯留時間短，水位波動較大，春季浮游植物群落中，以適應這種環境生長的硅藻占比最大[14]。本研究中水庫水體以小環藻為優勢藻，因為它們對P有較低半飽和濃度[15]，更適應自然的P限制環境，其次是以微囊藻為主的藍藻。野外轉移到室內，環境條件的變化導致部分不適應的藻類生長遲緩或停止，因此浮游植物的總豐度表現為初期急劇降低，到后期適應環境后上升。
與原水相比，添加N、P鹽顯著促進浮游植物的生長。然而，浮游植物總豐度與N/P比值(12~103)不相關，而與N、P的濃度有關，這表明水體N/P并不是影響藻細胞生長的唯一因素，而是應該結合N、P的絕對濃度來綜合考慮[27–28]。水體N/P比能夠指示水體中營養鹽的不平衡以及對單個或多個藻種的N限制或P限制，但并不能指示群落所需營養情況。由于不同優勢種對N、P濃度變化的響應不一致，即可能導致某種物種急劇上升，而其他物種急劇下降，這種補償機制會掩蓋群落總體豐度的變化，因而群落豐度與水體N/P比的相關性不明顯。除了N、P營養物質外，光照、水溫以及其他營養元素(鐵、硅等)[29]都可能影響到浮游植物的生長，成為浮游植物生長的限制因子。
浮游植物對營養鹽的變化和N/P比的響應具有種屬特異性。本試驗條件下，浮游植物群落對P鹽的響應程度要比N鹽顯著。高N條件下浮游植物的生長并沒有顯著優于對照，一方面可能是熱帶亞熱帶水庫浮游植物已對野外N充裕、P限制的環境有一定適應，另一方面是不同浮游植物利用營養鹽的方式存在差異[30],對N、P濃度變化的響應程度不一致導致群落的總體響應有差異。無論在指數期或穩定期，藍藻在高N(81.1mol/L)或高P(3.3mol/L)的營養條件下生長更好并占據優勢。在穩定期時,高N組中藍藻占據第1優勢，但其豐度并不隨P濃度升高而增加，這表明相對于P鹽，藍藻受N鹽的影響更大。綠藻隨P濃度的升高豐度增加,說明綠藻更喜好高P環境。另外，綠藻在N2濃度下的優勢更大，與藍藻喜好高N高P環境特性不同，綠藻更適合在中N高P的條件下生長。低P環境下硅藻相對有優勢，高N低P的環境可以促進硅藻豐度增加，但在與藍藻、綠藻的競爭的優勢不明顯，因而硅藻在N1濃度下占比更高。營養鹽的比例主要通過影響物種間的競爭對浮游植物群落產生影響。因此，研究N/P比值對浮游植物的顯著影響應固定在某一營養鹽濃度下進行探討更具有意義。
3.2優勢種對不同營養鹽的響應
水體中的N、P濃度及比值能顯著影響水體中優勢類群-硅藻的種類和豐度[30]。原水中硅藻門的小環藻屬始終為第1優勢種類，其次為金藻門的錐囊藻;指數期以微小四角藻為主的綠藻在磷酸鹽的競爭中為次優勢種，到了穩定期則被曲殼藻替代。小環藻優勢隨生長逐漸下降，而錐囊藻的優勢升高。硅藻相對豐度的減少與其對硅酸鹽的需求有關，此外，以錐囊藻為優勢種的金藻大量生長也會消耗水體中的硅酸鹽。與原水不同，同為硅藻優勢種之一的曲殼藻是N、P處理的絕對優勢種，可能是由于曲殼藻相比小環藻對水體硅的增加更為敏感[31]，添加N、P能促進曲殼藻吸收水體中的硅酸鹽用于自身生長,但在高濃度下效果降低，因此低N低P條件下曲殼藻占據優勢，這種優勢在穩定期更為明顯。
藍藻優勢種隱球藻在指數期高N高P下明顯占據優勢，在穩定期則被假魚腥藻、擬柱胞藻替代。由于后期營養鹽消耗降低，而假魚腥藻和擬柱胞藻具有固氮特性[32–33]，在環境無機氮不足時可以進行固氮，從而滿足生長要求，同時，還能夠儲存P以適應后期低營養鹽環境，這些機制使得其能超越隱球藻成為穩定期的優勢種之一。雙對柵藻作為綠藻門的主要優勢種，在N濃度為62.3µmol/L下有較好的生長優勢，鐮形纖維藻的適應范圍較窄，僅在N濃度為81.1µmol/L、P濃度為2.0µmol/L時占據第1優勢，到了穩定期更適應低營養鹽環境的假魚腥藻可以通過消耗儲存在體內的P鹽而繼續生長;雙對柵藻、卷曲纖維藻等綠藻優勢度較低，說明在營養鹽相對降低的條件藍藻更占優勢，生長后期一些綠藻競爭不過藍藻[32]，這與周起超[34]的研究結果相似。——論文作者：潘靜云1,楊陽2*,韓博平1
SCISSCIAHCI
