發布時間：2021-05-11所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:羥基酪醇是重要精細化學品，作為天然抗氧化劑被廣泛應用于食品、醫藥領域。通過合成生物學技術開展微生物法生產羥基酪醇具有重要的研究意義。本文首先克隆并功能鑒定了來源于大腸桿菌EscherichiacoliBL21的羥化酶編碼基因HpaBC，結果表明該酶的兩個亞基
摘要:羥基酪醇是重要精細化學品，作為天然抗氧化劑被廣泛應用于食品、醫藥領域。通過合成生物學技術開展微生物法生產羥基酪醇具有重要的研究意義。本文首先克隆并功能鑒定了來源于大腸桿菌EscherichiacoliBL21的羥化酶編碼基因HpaBC，結果表明該酶的兩個亞基均能成功表達并能催化酪醇生成羥基酪醇。通過CRISPR-Cas9技術將由tac啟動子調控的HpaBC基因表達盒整合到前期構建的酪醇高產菌株YMG5A*R基因組中，同時刪除副產物乙酸的合成途徑，獲得大腸桿菌代謝工程菌株YMGRD1H1。搖瓶發酵實驗結果表明重組菌株能夠直接利用葡萄糖生產羥基酪醇，產量達到1.81g/L，同時發現幾乎沒有副產物積累。5L發酵罐規模的流加補料發酵實驗表明羥基酪醇最高產量達到2.95g/L，是目前文獻報道以葡萄糖從頭合成羥基酪醇的最高水平。通過系統改造大腸桿菌，實現了羥基酪醇的大量合成，為進一步構建具有工業應用潛力的羥基酪醇細胞工廠奠定了基礎，也為拓展芳香族化合物的微生物制造路線提供了有益的參考。
關鍵詞:大腸桿菌，羥化酶，酪醇，羥基酪醇，CRISPR-Cas9
羥基酪醇(Hydroxytyrosol，HT)也稱3,4-二羥基苯乙醇(3,4-DHPEA)，分子量為154.164，是一種天然的苯乙醇類化合物，具有非常高的抗氧化活性[1-2]。長期食用橄欖油益于人體健康，其主要功能成分為羥基酪醇[3-4]。目前，羥基酪醇可應用于營養保健品、飼料、化妝品和制藥等多個行業，在食品防腐劑和添加劑等領域也具有廣闊的應用前景。目前，羥基酪醇主要從制備橄欖油或其廢水中提取[1]，少量為化學合成，微生物生產羥基酪醇的市場占有率極低。鑒于天然提取原料的匱乏和化學合成嚴苛的反應條件，利用微生物的細胞工廠安全高效地生產羥基酪醇成為必然趨勢。
如圖1所示，在微生物細胞內以酪氨酸為底物引入不同的外源基因，可以構建多種羥基酪醇合成途徑[1,5-7]。Chen等通過構建途徑1和途徑2兩種混合途徑生產羥基酪醇;針對途徑3通過篩選高活性的酪氨酸羥化酶和胺氧化酶構建出了高效的生產途徑，通過全細胞生物轉化方法生產的羥基酪醇產量最高為4.69g/L;同時針對途徑4構建了酪氨酸和葡萄糖的雙途徑生產羥基酪醇，但其產量依舊較低。上述代謝途徑均對羥化酶等基因進行了分析及改造，或構建混合酶體系的生產方式，對后續研究具有借鑒意義[7-8]。但上述途徑均主要以價格高昂的酪氨酸為底物，生產成本高;代謝途徑的構建在質�；A上進行，菌株的不穩定性易造成質粒的缺失;抗生素的使用為后期提取工藝及產品成分的限定造成阻礙，微生物發酵技術生產羥基酪醇有待進一步的研究。
本研究在前期研究[9]的基礎上，將以葡萄糖為底物的酪醇高產菌株YMG5A*R作為出發菌株，進一步構建羥基酪醇高產菌株。出發菌株YMG5A*R的主要代謝途徑如圖2所示，該菌株是以E.coliMG1655為宿主，在敲除相關分支途徑基因、調控阻遏基因等基礎上，整合表達5個拷貝的釀酒酵母菌株苯丙酮酸脫羧酶基因ARO10*。該重組菌能夠不需要添加抗生素及誘導劑條件下利用葡萄糖生產酪醇[10]。本文在高產酪醇基礎上，整合表達來源于E.coliBL21羥化酶基因HpaBC并進行乙酸副產物途徑改造，實現了代謝工程菌株高效生產羥基酪醇。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株及質粒
YMG5A*R為本研究的出發菌株，研究中所用及構建的菌株和質粒如表1所示。
1.1.2引物設計
研究中所用引物如表2所示。
1.1.3試劑
研究中所用蛋白胨和酵母粉等試劑均購于賽默飛公司;無機鹽等試劑均購自國藥化學試劑有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自上海麥克林生化科技有限公司;葡萄糖、阿拉伯糖、壯觀霉素、硫酸卡那霉素等購自生工生物工程(上海)股份有限公司;酪醇、羥基酪醇等標準品均購自Sigma-Aldrich(中國上海);限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ等均購自賽默飛世爾科技公司;連接酶SolutionⅠ、PrimeSTAR®DNA聚合酶、ExTaq酶、rTaq酶等均購于寶生物工程(大連)有限公司。
1.1.4培養基及緩沖
液LB培養基(g/L)：酵母粉5、蛋白胨10、NaCl10。固體LB培養基含有2.0%(W/V)瓊脂粉。滅菌條件為121℃、15min。
M9Y培養基(g/L)：Na2HPO4·12H2O17.1、KH2PO43、NaCl0.5、NH4Cl1、葡萄糖20、酵母粉0.25、5mmol/LMgSO4·7H2O。滅菌條件為115℃、15min。其中，MgSO4·7H2O母液需單獨滅菌，滅菌條件為121℃、15min。
PBS緩沖液(g/L)：NaCl8、KCl0.2、Na2PO41.42、KH2PO40.27。
1.2菌株構建
1.2.1羥化酶基因HpaBC的獲取及重組質粒構建
以菌株E.coliBL21基因組為模板進行PCR獲得羥化酶基因HpaBC(GenBank登錄號：CP053601.1)，通過引物將兩個限制性酶切酶位點EcoRⅠ、HindⅢ分別引入基因兩端。
將pEtac質粒和HpaBC基因用限制性內切酶EcoRⅠ、HindⅢ進行雙酶切后，用SolutionⅠ連接酶進行連接，轉入E.coliJM109感受態細胞中，篩選獲得JM109/pEtac-HpaBC菌株。
1.2.2重組菌株構建
采用化學轉化法將構建的重組質粒pEtacHpaBC轉入酪醇高產菌株YMG5A*R中，獲得游離表達羥化酶的重組菌株YMG5A*R/pEtac-HpaBC。
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采用CRISPR-Cas9技術[11]對出發菌株YMG5A*R基因組中產乙酸的關鍵基因poxB和ackA、pta[12]分別進行敲除。采用融合PCR的方法將poxB上下游同源臂進行連接，獲得poxB敲除盒，將其與質粒pTargetF和pCas共同轉入菌株YMG5A*R中篩選獲得陽性克隆，消除質粒后獲得poxB基因敲除的菌株YMGRD1。采用相同的方法構建ackA-pta基因敲除的菌株YMGRD2。采用上述方法獲得tac-HpaBC基因整合表達盒，將其與質粒pCas和pTargetF共同轉入菌株YMG5A*R中，篩選獲得陽性克隆YMGRD1H1。
1.3搖瓶發酵條件
將保藏的菌種在LB固體培養基上劃線培養，挑取單菌落接種于裝有20mLLB液體培養基的100mL錐形瓶中，于37℃、200r/min培養過夜。按1%接種量，轉接含有50mLLB液體培養基的250mL錐形瓶中，于37℃、200r/min培養10h后收集菌體。將其用無菌水洗一次，轉接至裝有50mLM9Y液體培養基的250mL錐形瓶中，于30℃、200r/min培養48h。每隔12h取樣檢測OD600和產物含量。其中，游離表達羥化酶時，菌體濃度OD600達到0.5時加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導。培養基中所需抗生素主要包括：卡那霉素(50mg/L)和壯觀霉素(100mg/L)。
1.4SDS-PAGE電泳條件
將YMG5A*R/pEtac-HpaBC菌株在LB培養基中誘導培養24h后，6000r/min離心10min，收集菌體。將菌體水洗一次后，用25mLPBS緩沖液重懸，破壁后離心取上清及沉淀，分別進行SDS-PAGE電泳驗證。
1.5發酵罐發酵條件
將菌株活化培養，以1%接種量接種到裝有50mLLB液體培養基的250mL錐形瓶中，于37℃、200r/min培養至OD600為1.5–2.0時，按照10%的接種量接種于裝有2LM9Y培養基的5L發酵罐中。
發酵過程通氣比恒定為1.5vvm，逐漸增加攪拌轉速維持發酵液DO值30%–40%至最高轉速600r/min;流加200g/L酵母粉母液(8mL/次)補充菌株生長所需養分促進菌株生長，繼續維持溶氧濃度。采用兩階段控溫發酵，0–14h為37℃，14–48h為30℃。發酵過程中，通過流加氨水自動控制發酵液pH=7.0。每間隔4h取樣檢測OD600、葡萄糖、酪醇和羥基酪醇產量。根據檢測結果，控制流加葡萄糖至終濃度維持在5g/L。
1.6檢測方法
1.6.1酪醇、羥基酪醇檢測方法
將發酵液沸水浴15min，離心收集上清，并采用微孔濾膜過濾。高效液相色譜(HPLC)分析條件如下：流速1mL/min;流動相為80%(V/V)的甲酸(0.1%，W/V)和20%(V/V)的純甲醇;博納艾杰爾C18柱(4.6mm×250mm，5μm);柱溫28℃;波長為280nm;紫外檢測器;進樣量為10μL。
1.6.2有機酸檢測方法樣品處理同1.6.1方法。HPLC分析條件如下：流速0.5mL/min;流動相為5mmol/L稀硫酸;博納艾杰爾有機酸分析柱(7.8mm×300mm，9μm);柱溫55℃;RID示差法檢測器;進樣量為10μL。
1.6.3葡萄糖檢測方法葡萄糖采用生物傳感分析儀(山東省科學院生物研究所)進行檢測。
2結果與分析
2.1羥化酶HpaBC的表達
采用質粒pEtac表達羥化酶HpaBC，將構建的重組菌YMG5A*R/pEtac-HpaBC進行誘導培養并SDS-PAGE電泳分析。如圖3所示，重組菌的全細胞電泳(泳道3)和細胞沉淀部分(泳道5)均有兩條顯著的蛋白電泳條帶，其大小分別在58kDa和19kDa左右，與4-羥基苯乙酸3-單加氧酶(HpaB)和黃素還原酶(HpaC)的理論分子量一致，表明HpaBC成功表達。由泳道4可以看出，在細胞破碎液的上清部分中，僅有明顯的HpaB蛋白條帶，表明HpaC基因表達產物多為包涵體。
2.2羥化酶HpaBC活性驗證
研究中進一步驗證了HpaBC基因表達產物是否具有催化生產羥化酪醇的活性。如圖4所示，重組菌株YMG5A*R/pEtac-HpaBC發酵48h，羥基酪醇產量達0.15g/L。但對照菌株YMG5A*R發酵液中未檢測到羥基酪醇積累，證明表達的HpaBC酶具有催化活性。但游離表達HpaBC酶時，重組菌的羥基酪醇產量較低，需要進一步改造提升羥基酪醇產量。
2.3乙酸合成途徑敲除
在羥基酪醇發酵生產過程中，重組菌株YMG5A*R/pEtac-HpaBC存在乙酸積累和pH降低等現象。大腸桿菌中的乙酸途徑主要包括兩個：①丙酮酸經poxB基因表達的丙酮酸氧化酶轉化為乙酸;②乙酰輔酶A經ackA、pta基因表達的乙酸激酶和磷酸轉乙酰酶轉化為乙酸。分別敲除菌株YMG5A*R中基因poxB、ackA-pta，構建了重組菌株YMGRD1和YMGRD2并考察乙酸合成水平。——論文作者：劉春筱1,2，夏媛媛1,2，齊麗娜1,2，楊海泉1,2，陳磊1,2，沈微1,2，陳獻忠1,2
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