番茄灰霉菌拮抗放線菌LA-5的篩選及鑒定

發布時間：2019-12-16所屬分類：農業論文瀏覽：1次

摘 要： 摘要 利用稀釋涂布法從番茄根際土壤中分離放線菌，并以番茄灰霉菌為靶標，利用對峙培養法和牛津杯法篩選拮抗放線菌，得到一株具有較強抑菌活性的放線菌LA-5.通過培養特征、生理生化特性及基于16SrDNA序列系統進化分析，將菌株LA-5初步鑒定為鏈霉菌.復篩結果

　　摘要 利用稀釋涂布法從番茄根際土壤中分離放線菌，并以番茄灰霉菌為靶標，利用對峙培養法和牛津杯法篩選拮抗放線菌，得到一株具有較強抑菌活性的放線菌LA-5.通過培養特征、生理生化特性及基于16SrDNA序列系統進化分析，將菌株LA-5初步鑒定為鏈霉菌.復篩結果顯示，LA-5發酵濾液對番茄灰霉菌孢子萌發及菌絲生長均有明顯的抑制作用，其中100倍發酵濾液對孢子萌發抑制率和菌絲生長抑制率均在50%以上;受抑制菌落呈白色，氣生菌絲萎縮稀疏，菌絲纖細、分支明顯減少.離體防效試驗顯示，菌株LA-5發酵原液對番茄灰霉病防效可達83.4%.該菌株有望開發為防治番茄灰霉病的生防菌株.

　　關鍵詞 番茄灰霉菌;鏈霉菌;抑菌活性;生物防治

　　由番茄灰霉菌(Botrytiscinerea)引起的灰霉病是一種世界性的病害.該病原菌產孢量大、寄主范圍廣泛，能夠侵染包括番茄、黃瓜、辣椒、草莓、葡萄等200多種作物，不僅在植株生長期間發生嚴重，而且在采后儲藏、運輸過程中也發生嚴重，對我國果蔬生產及產后儲藏造成了嚴重的經濟損失[1].灰霉病屬于低溫高濕病害，蔬菜、花卉等保護地重茬連作和高濕環境，為該病發生創造了更為有利的條件[2].目前，番茄灰霉病主要依靠化學防治，隨著用藥次數和用藥量不斷增加，加之病原菌遺傳變異迅速，病原菌的抗藥性也不斷增加.目前，番茄灰霉菌已對苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、N-苯氨基甲酸酯類、苯胺基嘧啶類和酰胺類殺菌劑產生了不同程度的抗性，防治效果逐年下降.而且大量化學農藥的使用嚴重威脅人們的食品安全和污染生態環境[3].國家農業部已提出到2020年，我國農業要實現“一控兩減三基本”的目標，其中主要農作物病蟲害綠色防控覆蓋率達到30%，化學農藥使用量實現零增長.因此，尋找可替代性生物農藥以克服農藥殘留和病菌的抗藥性將是灰霉病防治中亟需解決的重要問題.

　　放線菌存在于各種自然生態環境中，種類繁多，代謝功能各異，能夠產生種類豐富的次級代謝產物，是生物活性物質的重要來源.近年來，我國相繼成功開發了井岡霉素、春雷霉素、中生霉素等幾十種農用抗生素[4].不同結構類型的農用抗生素作用方式有很大差異，歸納起來有以下幾點，通過抑制幾丁質的合成來破壞病原真菌細胞壁的完整性;作用于真菌原生質膜造成溶質滲漏;作用于蛋白質合成系統阻礙肽鍵的形成;作用于能量代謝以及激活植物自身免疫，從而起到防治作用[5-6].Dame等[7]從海洋放線菌(Streptomycesspp.)中獲得的巴馬霉素(pamamycin)、寡霉素a(oligomycinA)、寡霉素b(oligomycinB)和棘孢鏈菌素(echinosporin)，通過抑制孢子游動導致孢子細胞壁溶解，從而有效防治葡萄霜霉病(Plasmoparaviticola).放線菌(Streptomycesspp.)TN258發酵提取物能夠使腐霉菌Pythiumultimum卵孢子扭曲畸形，菌絲生長受到極大的抑制[8].積雪草(Centellaasiatica)根節內生放線菌(Streptomycesspp.)CEN26代謝產生的2，5-雙(羥甲基)呋喃乙酸(BHMFOAC)化合物可導致甘藍黑斑病菌(Alternariabrassicicola)分生孢子畸形，附著孢不能形成及孢子萌發延遲[9].Shrivastava等[10]從印度恒河平原土壤中分離的嗜鹽放線菌K20，產生幾丁質酶來破壞菜豆殼球孢菌(Macrophominaphaseolina)的菌絲細胞壁，從而起到明顯的拮抗作用.

　　本研究從山西省平陸縣蔬菜大棚土壤樣品中分離到一株對番茄灰霉菌具有較好拮抗作用的放線菌LA-5，通過形態學、分子生物學等方法對其進行鑒定，在室內測定發酵濾液對番茄灰霉菌分生孢子萌發和菌絲生長的影響，并進行離體防效研究，旨在篩選對番茄灰霉病有拮抗作用的高效生防菌，為今后番茄灰霉病的生物防治奠定基礎.

　　1材料與方法

　　1.1供試材料

　　土壤樣品采自山西運城平陸縣蔬菜大棚，鏟去表層浮土，隨機在健康番茄植株根際挖取地表下5～10cm處新鮮土壤，裝入無菌自封袋，放入冰盒內，帶回實驗室存于4℃冰箱備用.供試病原菌番茄灰霉菌(Botrytiscinerea)分離自運城市鹽湖區北相鎮蔬菜種植大棚中番茄發病果實.

　　放線菌分離、純化和形態特征觀察采用高氏一號合成培養基;番茄灰霉菌培養和拮抗試驗采用馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養基;種子發酵培養基采用高氏一號液體培養基;基礎發酵培養基采用小米浸汁培養基[11];離體防效試驗中所用啶酰菌胺原藥購自上海源葉生物科技有限公司.

　　1.2土壤放線菌的分離與純化

　　采用平板稀釋法分離放線菌.將風干土樣用研缽磨碎，稱取10g倒入裝有90mL無菌水的三角瓶中，28℃180r·min-1震蕩30min后靜置5min，得到原液.取原液1mL并以10倍梯度稀釋，分別配制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的懸浮液，吸取不同濃度的懸浮液各0.2mL加到高氏一號培養基(含50mg·mL-1的K2GrO7)平板上，均勻涂布后置于28℃培養觀察，5～7d后挑取不同的單菌落劃線純化[12].

　　1.3拮抗放線菌菌株的篩選

　　1.3.1拮抗菌株的初篩采用對峙培養法進行篩選[13].將放線菌接種在高氏一號瓊脂培養基平板培養7d，用打孔器打取φ=7mm的菌餅待用.制備PDA培養基平板，將番茄灰霉菌菌餅(φ=7mm)接種于平板中央.以此為中心，按照正方形的布局將同種放線菌菌餅接種在距病原菌1.0cm的正方形邊長中點處，以只接種病原菌為對照.23℃恒溫培養5d，觀察病原菌菌落是否形成隔離區間，并測量放線菌菌落邊緣與病原菌菌落邊緣的距離，每處理重復3次.

　　1.3.2放線菌的抑菌活性復篩對初篩具有拮抗效果的放線菌進行發酵，首先將待測菌接種在小米培養基上，28℃180r·min-1振蕩培養72h，制成種子液，然后再按10%的接種量接入到裝液量為150mL的發酵培養基中(250mL三角瓶)，在上述條件下振蕩培養5d，發酵結束后，分離發酵液和菌體，發酵液先用孔徑為0.45μm的微孔濾膜抽濾，再用孔徑為0.22μm的無菌濾器過濾到無菌離心管中置于4℃保藏備用.

　　濾紙條法:采用濾紙條法測定菌株發酵液對番茄灰霉菌的抑制作用[14].將50mL發酵7d、108CFU·mL-1的菌株發酵液置于50mL離心管中，8000r·min-1離心取上清液，然后用微孔濾膜(0.22μm)抽濾除菌，得無菌發酵液，置于滅菌容器中4℃保藏備用.用發酵液浸潤無菌濾紙條，晾干后對稱貼在PDA培養基中，培養皿圓心位置接種番茄灰霉菌菌餅，以無菌水作為對照，重復3次.

　　牛津杯法:制備濃度為1.0×107個·mL-1番茄灰霉菌孢子懸浮液，將150μL孢子懸浮液均勻涂布在PDA平板上，待吹干后，將7.8mm×6mm×10mm的無菌牛津杯均勻放置在PDA平板上，并輕輕按壓使之與培養基充分接觸.將放線菌無菌發酵濾液200μL置于牛津杯中，以無菌水為對照，將平板置于23℃下恒溫培養3d，觀察是否有抑菌圈出現，并測量抑菌圈的大小，每處理3個重復.

　　1.4拮抗菌株的鑒定

　　1.4.1表型特征和生理生化測定在高氏一號培養基上劃線培養，培養基內傾斜插入無菌蓋玻片，7～10d后通過光學顯微鏡、掃描電鏡觀察菌絲形態、孢子特征，并隨時觀察菌落形態、基內菌絲顏色及可溶性色素的有無，參考文獻報道的方法對菌株進行初步鑒定[15].菌株生理生化特性分析參照《鏈霉菌鑒定手冊》[16]和《放線菌分類基礎》[17]等的方法.

　　1.4.2分子鑒定以細菌基因組DNA提取試劑盒(艾德萊)提取放線菌基因組DNA，以細菌16SrDNA通用引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R:5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'作為擴增引物進行PCR擴增.50μL反應體系:2×TaqMasterMix25μL、DNA模板1μL、上下游引物各1μL，超純水(ddH2O)補足至50μL.反應程序為:94℃預變性5min;94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環;72℃終延伸10min[18].

　　PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，切膠回收后送到上海生工生物工程有限公司進行測序，測序結果與GenBank數據庫中序列進行Blast分析比對，調出與其序列同源性較高的相關模式菌株的16SrDNA序列.采用MEGA6.0軟件中鄰接法(neighbour-joining，N-J)構建系統發育樹，確定菌株分類地位[19-20].

　　1.5菌株對番茄灰霉菌的抑菌活性及防效測定

　　1.5.1發酵濾液對番茄灰霉菌菌絲生長的影響試驗

　　采用菌絲生長速率法:23℃培養箱內將番茄灰霉菌在培養基平板上培養5～7d后，用打孔器在菌落邊緣取直徑7mm菌餅.將無菌發酵原液與冷卻至50℃左右的PDA培養基按照20%、10%、2%、1%、0.5%和0.25%比例混勻，使其稀釋成5、10、50、100、200和400倍發酵濾液，然后分別制成含藥培養基平板.在平板中央接種番茄灰霉菌菌餅(φ=7mm)，設置3個重復，以加入等量無菌水的處理為對照，23℃下恒溫培養5d后，用十字交叉法測量菌落生長直徑，根據以下公式計算菌株的平均菌絲生長抑制率.挑取各處理及對照菌落菌絲，在光學顯微鏡下觀察菌絲形態變化[21].

　　菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-7)×100%

　　1.5.2發酵濾液對番茄灰霉菌孢子萌發的影響試驗

　　制備濃度為1.0×107個·mL-1番茄灰霉菌孢子懸浮液，將放線菌菌株發酵液與無菌水以20%、10%、2%、1%、0.5%和0.25%比例混勻，使其稀釋成5、10、50、100、200和400倍，將適量番茄灰霉菌孢子懸浮液母液滴加到稀釋后的發酵液中，制成終濃度為1.0×105個·mL-1的孢子懸浮液，以無菌水為對照，每個處理3個重復，于23℃暗培養48h后鏡檢，每處理觀察3個視野，每個視野觀察30個分生孢子，光學顯微鏡下統計孢子萌發的數量.以抽出芽管、長出菌絲為標準，判斷孢子是否萌發.重復3次，按公式計算孢子萌發率.

　　孢子萌發抑制率=(對照孢子萌發率-處理孢子萌發率)/(對照孢子萌發率)×100%

　　1.5.3菌株發酵液對番茄灰霉病的防治效果試驗利用組織法測定放線菌發酵液對番茄灰霉病的防治效果.選取直徑約5cm、大小相似、生長健康的番茄果實35，平均分為7組，分別先以放線菌菌株無菌發酵液原液、10、20、50、100倍液作為保護劑對番茄噴霧處理，噴霧量以剛好均勻、不產生滴液為宜.待晾干后用106個·mL-1番茄灰霉菌孢子懸浮液接種果實微創傷口，接種量以噴霧均勻不產生滴液為宜.實驗以無菌水作為陰性對照(CK)，3.9μg·mL-1的啶酰菌胺為陽性對照，設置3個重復，5d后測量并記錄病斑面積，計算防效.

　　1.6數據處理

　　采用Excel2016軟件進行數據處理，采用DPS7.5統計分析軟件對數據進行差異顯著性檢驗(Duncan氏新復極差法，α=0.05).

　　2結果與分析

　　2.1放線菌分離結果

　　將土壤樣品制成懸液并以10倍逐級稀釋，將懸液均勻涂布在高氏一號瓊脂培養基平板上，置于28℃培養箱內培養5～7d，3份土樣中共分離到放線菌23株，根據菌落形態、顏色初步去除重復，獲得放線菌純培養18株，編號分別為LA-1～LA-18.

　　2.2拮抗放線菌的篩選

　　2.2.1拮抗放線菌初篩根據平板對峙培養結果，對番茄灰霉菌具有抑制作用的放線菌有4株，其中抑菌效果最高的菌株編號為LA-5，抑制率高達72.6%(圖1、表1).

　　2.2.2拮抗放線菌復篩將初篩得到效果較好的LA-5進行發酵，用牛津杯法對放線菌抑菌活性進行復篩.結果表明，放置發酵液的牛津杯邊緣出現明顯的抑菌圈，抑菌圈直徑可達28.7mm(圖2);濾紙條試驗表明，蘸取發酵液的無菌濾紙條可以明顯抑制菌落生長，菌落生長狹長，而對照組病原菌能越過濾紙條，無障礙生長.因此，放線菌LA-5可作為番茄灰霉菌生防菌進行后續試驗.

　　2.3菌株LA-5鑒定結果

　　2.3.1形態及培養特征菌株LA-5在高氏一號培養基上菌落扁平狀，黑褐色，孢子絲顏色黑灰色，培養10d后產咖啡色可溶性色素，菌落背面呈棕黑色(圖3);光學顯微鏡下基絲不斷裂、氣生菌絲形成孢子絲，孢子絲直、柔曲;在掃描電鏡下觀察，孢子為短圓柱形，表面光滑、鏈生;軸長約0.6μm，徑長約1.0μm(圖4).在大多數培養基上生長良好，在不同鑒別培養基上的培養特征見表2.

　　2.3.2生理生化特征菌株生理生化特性分析參照《鏈霉菌鑒定手冊》[16]和《放線菌分類基礎》[17]等的方法進行.結果表明，菌株LA-5能使淀粉水解、牛奶凝固和胨化，以及明膠液化，不能使硝酸鹽還原和產生硫化氫;能很好利用纖維素、D-葡萄糖、蔗糖，不能利用麥芽糖、鼠李糖、D-果糖(表3).

　　2.3.3分子鑒定從LA-5新鮮菌體中提取基因組DNA，采用通用引物(27F和1492R)進行16SrDNA擴增，PCR產物經檢測后測序.結果表明，菌株LA-5的16SrDNA核苷酸全序列總長為1391bp.將所得序列提交到GenBank獲得登錄號MH102299，與GenBank中已登錄的基因序列進行BLAST分析比對，發現與菌株LA-5同源性高于98%的菌株均屬于鏈霉菌屬，選取12個典型菌株的16SrDNA序列用MEGA6.0軟件Neighbor-Joining法構建系統進化樹構建系統發育樹.結果表明，菌株LA-5與Streptomyceschungwhensis屬于同一分支，其序列最大相似性為99%(圖5).因此將菌株LA-5初步鑒定為S.chungwhensis.

　　2.4菌株LA-5對番茄灰霉菌的抑菌活性及防效

　　2.4.1發酵濾液對番茄灰霉菌分生孢子萌發的抑制作用經發酵濾液處理的孢子懸液置于23℃培養箱暗培養48h，結果表明，LA-5發酵濾液對番茄灰霉菌分生孢子萌發具有抑制作用.稀釋5倍發酵濾液對番茄灰霉菌孢子萌發抑制率達100%，隨著稀釋倍數增加，對孢子萌發抑制率逐漸下降，其中，100倍發酵濾液對病原菌孢子萌發抑制率仍在50%以上，當稀釋到400倍時，孢子萌發抑制率小于10%，基本失去抑制作用(表4).

　　2.4.2發酵濾液對番茄灰霉菌菌絲生長的抑制作用LA-5發酵濾液對番茄灰霉菌菌絲生長具有抑制作用，稀釋5倍發酵濾液對病原菌菌絲生長抑制率大于90%，當發酵濾液稀釋100倍時，菌絲抑制率下降到51.3%，隨著稀釋倍數增加，菌絲抑制率逐漸下降，當稀釋400倍時，菌絲抑制率為6.4%，基本失去抑制作用(表4).形態觀察結果表明，對照組菌落呈灰色，氣生菌絲發達茂盛，菌絲顏色較深，分支發達;而經LA-5發酵濾液處理的菌落呈白色，氣生菌絲稀疏，菌絲纖細，分支極少(圖6).

　　2.4.3發酵濾液對番茄灰霉菌的離體防效將LA-5發酵濾液稀釋后進行離體防效測定，結果表明，3.9μg·mL-1的啶酰菌胺對灰霉菌的防治效果為85.1%，發酵濾液對番茄灰霉菌具有良好的防治效果，可有效抑制病斑的擴展.發酵濾液原液的防效高達83.4%，與陽性對照無顯著差異;當發酵濾液稀釋到50倍時，防治效果下降到52.3%，稀釋到100倍時，防效下降到11.3%，基本失去防治作用(表5).

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