干酪乳桿菌的近緣種及亞種部分看家基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

發(fā)布時間：2019-11-28所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1359次

摘 要： 摘 要：【背景】16S rRNA 基因序列分析已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的分類鑒定，但是存在一定局限性，而使用看家基因作為分子標(biāo)記在近緣種及亞種間的系統(tǒng)發(fā)育分析中具有其獨特的優(yōu)勢。【目的】研究 16S rRNA、uvrC (核酸外切酶 ABC，C 亞基)和 murE (UDP-N-乙酰胞壁酰三

　　摘 要：【背景】16S rRNA 基因序列分析已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的分類鑒定，但是存在一定局限性，而使用看家基因作為分子標(biāo)記在近緣種及亞種間的系統(tǒng)發(fā)育分析中具有其獨特的優(yōu)勢。【目的】研究 16S rRNA、uvrC (核酸外切酶 ABC，C 亞基)和 murE (UDP-N-乙酰胞壁酰三肽合酶)基因序列對干酪乳桿菌的近緣種及亞種的區(qū)分能力。【方法】采用分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳中的 6 株干酪乳桿菌為研究對象，選取 uvrC 和 murE 基因片段，通過 PCR 擴增、測序，結(jié)合已公布的干酪乳桿菌的近緣種或亞種的相應(yīng)序列計算遺傳距離、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并與 16S rRNA 基因序列分析技術(shù)進(jìn)行比較。【結(jié)果】研究發(fā)現(xiàn) Lactobacillus casei 及相近種間的 uvrC、murE 和聯(lián)合基因 (uvrC-murE)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與 16S rRNA 基因結(jié)果基本一致，區(qū)別在于相似性的不同，其分別為79.00%−99.16%、89.08%−99.20%、76.56%−99.69%和99.58%−100%。基于16S rRNA 基因不能區(qū)分干酪乳桿菌的近緣種及亞種，而看家基因 uvrC 和 murE 基因序列能夠很好地區(qū)分干酪乳桿菌的近緣種及亞種，并且將 uvrC 和 murE 基因串聯(lián)使用后，試驗菌株與參考菌株的分類關(guān)系更加清晰。【結(jié)論】聯(lián)合基因(uvrC-murE)可作為 16S rRNA 基因的輔助工具用于干酪乳桿菌的近緣種及亞種的快速準(zhǔn)確鑒定。

　　關(guān)鍵詞：干酪乳桿菌，系統(tǒng)發(fā)育分析，16S rRNA 基因，uvrC，murE

　　干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)是革蘭氏陽性、兼性厭氧的乳桿菌屬中的一個種，對營養(yǎng)條件和發(fā)酵條件要求嚴(yán)格[1]。它通常存在于生乳或發(fā)酵乳制品、人和動物的腸道以及新鮮蔬菜或發(fā)酵蔬菜制品中[2]。干酪乳桿菌是一種具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、促進(jìn)人體消化吸收以及增強免疫等多種功能的益生菌[3-4]。本研究團隊自主分離、篩選自內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中的 Lactobacillus casei Zhang 是性能優(yōu)異的益生菌[5]，它具有較強的耐人工胃液、膽鹽消化、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等益生功效[6-9]。

　　長期以來，干酪乳桿菌及其近緣種的分類學(xué)地位一直存在爭議。干酪乳桿菌菌群經(jīng)歷了從早期的 Lactobacillus casei subsp. casei、Lactobacillus casei subsp. alactosus、Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum 、 Lactobacillus casei subsp. tolerans 和 Lactobacillus casei subsp. rhamnosus，到 L. casei/paracasei、L. rhamnosus、L. zeae，直到現(xiàn)在 L. casei、L. paracasei、L. rhamnosus 的劃分[10-14]。由此可以看出，干酪乳桿菌及其近緣物種間的親緣關(guān)系錯綜復(fù)雜，種內(nèi)分類學(xué)地位一直存在爭議，基于傳統(tǒng)的分類學(xué)方法只能勉強將其從種水平上區(qū)分開來，因此急需一種快速準(zhǔn)確且分辨率較高的分類鑒定方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，產(chǎn)生了許多新的分類鑒定方法，如隨機擴增 DNA 多態(tài)性[15]、種特異性 PCR[16]、核糖體分型[17]、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析[18]，但是以上方法在分類鑒定中存在一定的局限性。16S rRNA 基因序列的比較分析是細(xì)菌分類和鑒定的常用分子方法。但 Mori 等[19]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌及其近緣種間的 16S rRNA 基因序列相似性超過 99%，因此使用該方法無法對干酪乳桿菌及其近緣種種內(nèi)進(jìn)行分類鑒定。劉光全等[20]嘗試采用不同看家基因分析干酪乳桿菌群的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，同時證明看家基因 pheS比 16S rRNA 基因具有更高的分辨率。這提示我們，看家基因能夠區(qū)分鑒定干酪乳桿菌及其近緣種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

　　本研究分析了 12 株干酪乳桿菌的 16S rRNA、看家基因 uvrC (核酸外切酶 ABC，C 亞基)和 murE (UDP-N- 乙酰胞壁酰三肽合酶 ) 基因序列，與 GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載模式菌株的 16S rRNA、 uvrC 和 murE 以及 uvrC-murE 串聯(lián)基因序列比對分析，對 12 株干酪乳桿菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行全面地闡述。本研究為我國優(yōu)良益生菌株的篩選及快速鑒定奠定堅實的理論基礎(chǔ)。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 試驗菌株

　　研究所用 6 株干酪乳桿菌均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室提供，詳細(xì)信息見表 1。Bao 等[2]運用 10 種看家基因(carB、 clpX 、 dnaA 、 groEL 、 murE 、 pyrG 、 pheS 、 recA、rpoC、uvrC)對 224 株干酪乳桿菌進(jìn)行多位點序列分型研究(MLST)，本研究從中隨機選取 6 株干酪乳桿菌(為了方便描述，下稱已發(fā)表菌株)，共構(gòu)建 12 株菌的菌株集，以驗證本研究中分型方法的普適性。菌株的具體信息見表 2。另外，本研究還選取 5 株干酪乳桿菌及其近緣種的模式菌株作為參考菌株，具體信息見表 3。

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　　1.1.2 主要試劑和儀器

　　MRS 培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱有限公司;PCR 試劑，大連 TaKaRa 公司;Applied biosystems PCR 儀，伯樂公司;微量紫外分光光度計，NanoDrop 公司;全自動高壓蒸汽滅菌器，Hirayama 公司;恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司;凝膠成像分析系統(tǒng)，UVP 公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京一恒科技有限公司;電子天平，上海精天電子儀器有限公司;高速冷凍離心機，Eppendorf 公司;電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

　　1.1.3 試驗所用引物

　　通過比較基因組學(xué)分析，選擇 uvrC 和 murE 兩個單拷貝且含有多變區(qū)的基因為目標(biāo)序列。結(jié)合序列比對信息，采用 Primer 5.0 設(shè)計通用引物(表 4)，引物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成。

　　1.2 DNA 提取、PCR 擴增和測序

　　采 用 CTAB-液氮凍融法提取菌株基因組 DNA[21]。將提取的基因組 DNA 稀釋至 100 ng/μL 左右作為PCR擴增模板。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：DNA 模板(100 ng/μL) 1 μL，10×Easy Taq buffer (Mg2+) 5 μL，High Pure dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，正、反向引物(10 mmol/L)各 1.5 μL，DNA 聚合酶 (5 U/μL) 0.5 μL，去離子水補充至 50 μL[22]。uvrC 基因的 PCR 反應(yīng)條件：95 °C 5 min;95 °C 1 min，60 °C 45 s，72 °C 1 min，30 個循環(huán);72 °C 10 min。murE 基因的 PCR 反應(yīng)條件除了退火溫度為 52 °C，其余反應(yīng)條件均與 uvrC 基因一致。PCR 產(chǎn)物用 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將擴增成功的產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

　　1.3 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

　　6 株試驗菌株的 uvrC 和 murE 基因擴增產(chǎn)物經(jīng)純化、測序獲得其相對應(yīng)的核苷酸序列，上傳至 NCBI，已獲得登錄號(表 1)。所有菌株的 16S rRNA基因序列均下載自GenBank數(shù)據(jù)庫(序列登錄號見表 1、表 2 和表 3)，6 株已發(fā)表菌株及 5 株參考菌株的 uvrC 和 murE 基因序列從 GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載(序列登錄號見表 2、表 3)。采用 MEGA 6.0 軟件進(jìn)行 ClustalW 比對，運用鄰接法 (Neighour-Joining，N-J)分別構(gòu)建基于 16S rRNA、 uvrC 和 murE 基因序列以及 uvrC-murE 串聯(lián)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，數(shù)據(jù)自展重復(fù)抽樣次數(shù) 1 000 次。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 基于 16S rRNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

　　根據(jù) 12 株試驗菌株和 5 株參考菌株的 16S rRNA 基因序列，采用 N-J 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，計算其進(jìn)化距離，結(jié)果如圖 1 所示。結(jié)果顯示， 17 株菌共劃分為兩大類(I、II)，I 類群分為 2 個亞群(A、B)。I 類群的 A 亞群中 12 株菌株與 L. paracasei subsp. tolerans DSM20258T 、 L. paracasei subsp. paracasei DSM5622T 聚為一類，它們兩兩之間的16S rRNA基因序列平均相似性均為 99.99%。其中，模式菌株 L. paracasei subsp. tolerans DSM20258T 和 L. paracasei subsp. paracasei DSM5622T 以 100%的相似性聚為一類。 A 亞群菌株與 B 亞群中的菌株 L. casei DSM20011T 、L. zeae DSM20178T 兩兩之間的平均相似性為 99.70%。I 類群與 II 類群的平均差異性較小，僅為 0.46%。

　　劉光全等[20]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌與其近緣種的一致性都在 99%以上，二者不能通過 16S rRNA 基因被有效區(qū)分開。本研究得到相同的結(jié)果， 16S rRNA 基因序列很難區(qū)分干酪乳桿菌的近緣種及亞種，需要選用一種比 16S rRNA 基因分辨率高的方法對其進(jìn)行分類鑒定。

　　2.2 基于 uvrC 基因部分序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

　　基于 uvrC 基因部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，12株試驗菌株與5株參考菌株構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹仍形成較為穩(wěn)定的兩個大類(I、II)，I 類群分成 3個亞群(A、B、C)，但相似性與16S rRNA基因不同。如圖 2 所示，I 類群中 12 株菌株和 3 株參考菌株聚為一類。 A 亞群即菌株 IMAU10787 、 IMAU70074、IMAU10541、IMAU70046 與參考菌株 L. casei DSM20011T 為一個分支，菌株 IMAU80810、IMAU80732、IMAU80853 與參考菌株 L. paracasei subsp. paracasei DSM5622T聚為一小分支，菌株 IMAU10532 、 IMAU80452 、 IMAU10847、IMAU20578 和參考菌株 L. paracasei subsp. tolerans DSM20258T聚為 C 類，它們基因序列兩兩之間的相似性大于 97.38%。IMAU80303 未與參考菌株劃分為一類，它與模式菌株 L. paracasei subsp. tolerans DSM20258T 、 L. casei DSM20011T 、 L. paracasei subsp. paracasei DSM5622T 的相似性分別為 98.46%、99.12%、 98.68%。A亞群與B亞群兩兩菌株之間的基因平均相似性為 81.63%，與 C 亞群之間基因平均相似性為 79.00%。Ⅱ類群中 L. rhamnosus DSM20021T和 L. zeae DSM20178T的基因差異性為 19.16%，比 16S rRNA 基因序列有更大的差異性。結(jié)果顯示，相較于 16S rRNA 基因序列，uvrC 基因序列在干酪乳桿菌的近緣種及亞種的分類中有較高的分辨率。

　　2.3 基于 murE 基因部分序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

　　基于 murE 基因部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 3 所示，12 株菌與 5 株參考菌構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹仍形成較為穩(wěn)定的兩個大類(I、II)。I 類群中 12 株菌和 3 株參考菌聚為一類，I 類群又分為 3 個小的分支(A、B、C)。菌株 IMAU80303、IMAU10847 和參考菌株L. paracasei subsp. paracasei DSM5622T 聚為一小分支，菌株 IMAU10532、IMAU80853、 IMAU80452 、 IMAU80810 、 IMAU20578 、 IMAU80732 與參考菌株 L. paracasei subsp. tolerans DSM20258T 聚 為 B 類，菌株 IMAU10541 、 IMAU70046、IMAU10787、IMAU70074 與參考菌株 L. casei DSM20011T聚為另一分支。它們基因序列兩兩之間的相似性大于 98.81%。A 亞群與 B 亞群兩兩菌株之間的基因平均相似性為 92.47%，與 C 亞群之間基因平均相似性為 89.08%。模式菌株 L. paracasei subsp. tolerans DSM20258T 和 L. paracasei subsp. paracasei DSM5622T的平均差異達(dá)到 0.2%，比 16S rRNA 基因序列有更大的差異性。結(jié)果表明，murE基因區(qū)分干酪乳桿菌的近緣種及亞種的分辨率高于 16S rRNA 基因，因此利用 murE 基因能很好地區(qū)分干酪乳桿菌的近緣種及亞種。

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