發布時間：2014-06-14所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 論文摘要：臨床研究顯示，蠲痹顆粒能明顯改善RA活動期的臨床癥狀，降低C-反應蛋白、紅細胞沉降率、類風濕因子等實驗室指標，有效率占82.5%。前期實驗研究表明，蠲痹顆粒不僅具有明顯的抗炎、免疫抑制作用，而且對大鼠佐劑性關節炎及小鼠膠原誘導性關節炎具有
論文摘要：臨床研究顯示，蠲痹顆粒能明顯改善RA活動期的臨床癥狀，降低C-反應蛋白、紅細胞沉降率、類風濕因子等實驗室指標，有效率占82.5%。前期實驗研究表明，蠲痹顆粒不僅具有明顯的抗炎、免疫抑制作用，而且對大鼠佐劑性關節炎及小鼠膠原誘導性關節炎具有顯著的治療作用。
引言
類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以侵蝕性關節炎為主要表現的全身性自身免疫性疾病。我國大陸地區的RA患病率為0.20%～0.40%[1]。在RA自然病程中，5～10年的致殘率為60%，30年的致殘率為90%，壽命縮短10～15年，而伴關節外表現者的5年生存率僅為50%[2]，極大地影響了患病人群的生活質量，開展干預RA研究對于人類健康具有戰略性意義�；ぱ妆徽J為是RA發生發展的重要機制，因此深入研究其發病機制及可能的干預手段成為當前醫學界治療RA的熱點問題。本研究旨在以溫陽散寒除濕法組方的蠲痹顆粒為研究載體，探討中醫藥干預RA關節病變進程的機制，為中醫藥干預炎癥指標表達的機制提供理論和實驗基礎。
1 實驗材料
1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠50只，雄性，8周
齡，體質量(180±20)g，購自簡陽達碩動物科技有限公司，動物許可證號SCXK(川)：2008-24。飼養于云南省中醫醫院中心實驗室SPF級動物房。實驗前適應性喂養1周，自由攝水攝食。動物房溫度維持在20 ℃，濕度維持在70%。
1.2 藥品與試劑 牛Ⅱ型膠原(CⅡ)，購自sigma公司。完全弗氏佐劑(CFA)，購自美國BD公司。蠲痹顆粒(JB，主要由附片、川芎、赤芍、桂枝、麻黃、薏苡仁、五加皮等10余味中藥組成)由本院藥劑科提供。甲氨蝶呤片，上海信誼藥廠有限公司生產(批號H31020644)。大鼠白細胞介素(IL)-1β Elisa試劑盒，購自欣博盛生物科技有限公司，實驗操作步驟嚴格按說明書執行。
2 實驗方法
2.1 動物分組 按隨機數字表法將動物隨機分為蠲痹低劑量組、中劑量組、高劑量組，甲氨蝶呤組，模型對照組及空白對照組(前4組每組10只，后2組每組5只)。
2.2 動物造模 除空白對照組外，其余大鼠均造模。實驗前1天將牛Ⅱ型膠原溶于0.1 mol·L-1醋酸中，配制成總濃度為2 mg·mL-1的溶液，置于4 ℃冰箱過夜。冰浴下按照1∶1比例與CFA充分混勻，乳化，制成乳劑。以0.5 mL質量分數5%苯巴比妥麻醉大鼠，待麻醉后于距鼠尾根部2～3 cm
處注射，每只200 μL。
2.3 給藥方法 致炎第21天起每日給藥干預，蠲痹高、中、低劑量組分別以12.0 g·kg-1·d-1、
4.0 g·kg-1·d-1和2.0 g·kg-1·d-1蠲痹顆粒水溶液灌胃，甲氨蝶呤組每周1次給予甲氨蝶呤水溶液10 mg·kg-1
灌胃，模型對照組與空白對照組均給予生理鹽水灌胃
10 mL·kg-1·d-1。實驗期間均予SPF級普通飼料。分別于給藥14 d和28 d(即實驗第35天和第49天)各處死一半動物，活殺取血和滑膜組織備測。
2.4 關節炎癥狀評分 第1天初次免疫前開始，每隔7天采用關節炎指數(AI)評分法及足趾容積測量法評價關節炎病變的發生及嚴重程度。關節炎指數分為5級(0～4分)：0分，正常;1分，踝關節或腕關節輕度發紅、腫脹，或明顯的發紅腫脹局限于足趾，不論受累數目;2分，踝關節或腕關節中度發紅、腫脹;3分，踝關節或腕關節重度發紅、腫脹;4分，多關節最大程度的炎癥腫脹。最高可計4分。于AI評估同時，用足趾容積測量儀測量足爪炎癥及腫脹程度。
2.5 取血方法及血清的制備 各組最后1次灌胃后開始禁食，第2天取血，采用腹主動脈采血法取血并處死動物;血液靜置2 h后，置于3 000 r·min-1離心機，離心10 min，取上清，置于-80 ℃冰箱保存備用。
2.6 大鼠滑膜組織的收集 大鼠處死后，仰位固定，迅速離斷四肢，剝離皮膚，用冷生理鹽水沖洗干凈后置于冰上操作;沿踝關節后方打開關節囊，可見有一層平滑光亮呈淺淡黃色的滑膜組織;用眼科直鑷鈍性分離關節囊的滑膜層和纖維層，完整剝離滑膜組織;最后以眼科鑷輕輕夾住其中央，用眼科剪完整剪下滑膜組織，常規脫鈣包埋，切片備用。
2.7 滑膜炎癥評分 ①炎細胞浸潤：0分，無炎細胞;1分，稀疏散在;2分，較密集;3分，大量。②纖維組織增生：0分，無纖維組織增生;1分，少量增生;2分，中量增生;3分，大量增生。③滑
膜細胞增生：0分，無滑膜細胞增生;1分，單層細胞腫脹密集;2分，兩層細胞腫脹密集;3分，三層細胞腫脹密集。④巨噬樣A型細胞增生：0分，無巨噬樣A型細胞;1分，稀疏散在;2分，較密集;3分，大量。
2.8 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料以進行統計描述，正態分布資料組間數據比較采用方差分析(ANOVA);偏態分布資料組間數據比較采用秩和檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。
3 結 果
3.1 一般情況觀察 實驗期間，因炎癥反應較重，共有4只大鼠死亡(低劑量組1只，高劑量組1只，甲氨蝶呤組2只)�？瞻讓φ战M大鼠精神佳，毛色光澤，飲食正常。模型對照組大鼠易激惹，皮毛粗糙無光澤，瘦弱少食，體質量增長緩慢，部分大鼠行動困難。蠲痹低劑量組大鼠皮毛粗糙發黃，瘦弱懶動，蠲痹中、高劑量組和甲氨蝶呤組大鼠皮毛較光澤、精神可、飲食較好。
3.2 各組CIA大鼠35 d、49 d AI評分比較 35 d
時，蠲痹低劑量組、甲氨蝶呤組CIA大鼠AI評分比空白對照組顯著增加，差異有統計學意義
(P < 0.05);其他組AI評分有增加趨勢，但差異無統計學意義(P > 0.05)。49 d時，甲氨蝶呤組CIA大鼠AI評分比空白對照組顯著增加，差異有統計學意義(P < 0.05);且蠲痹高劑量組在改善AI評分上明顯優于甲氨蝶呤組(P < 0.05)。見表1。
表1 各組CIA大鼠35 d、49 d AI評分比較 分，
組別 35 d 49 d
蠲痹低劑量組 1.50±1.351) 1.00±1.41
蠲痹中劑量組 0.60±1.08 1.00±1.41
蠲痹高劑量組 0.50±1.23 0.50±1.002)
甲氨蝶呤組 1.60±1.271) 2.60±1.501)
模型對照組 1.20±1.64 1.50±2.12
空白對照組 0 02)
注 與空白對照組同期比較，1)P < 0.05;與甲氨蝶呤組同期比較，2)P < 0.05
3.3 各組CIA大鼠不同時間點足容積比較 35 d時，
蠲痹低劑量組CIA大鼠
趾容積比空白對照組顯著增加，差異有統計學意義(P < 0.05)，其他組足趾容積有增加趨勢，但差異無統計學意義;49 d時，各給藥組與模型對照組比較，足趾容積有減小趨勢，但差異無統計學意義(P > 0.05)。見表2。
表2 各組CIA大鼠不同時間點足容積比較 mL，
組別 0 d 35 d 49 d
蠲痹低劑量組 1.61±0.11 2.70±0.761) 2.42±0.67
蠲痹中劑量組 1.61±0.06 2.13±0.65 2.49±0.46
蠲痹高劑量組 1.58±0.08 2.08±0.73 1.91±0.45
甲氨蝶呤組 1.57±0.09 2.47±0.59 2.52±0.43
模型對照組 1.66±0.06 2.55±0.96 2.58±1.11
空白對照組 1.62±0.12 1.74±0.17 1.96±0.09
注 與空白對照組同期比較，1)P < 0.05
3.4 各組CIA大鼠35 d、49 d IL-1β比較 35 d時，
血清IL-1β水平，各組與模型對照組比較，差異有統計學意義(P < 0.01);蠲痹高劑量組在改善血清IL-1β水平上優于甲氨蝶呤組(P < 0.05)。49 d時，各組與模型對照組比較，差異有統計學意義(P < 0.01)，蠲痹中、高劑量組在改善血清IL-1β水平上明顯優于甲氨蝶呤組(P < 0.01)。見圖1、表3。
圖1 大鼠血清IL-1β Elisa檢測標準曲線
表3 各組CIA大鼠35 d、49 d IL-1β比較 Pg·mL-1，
組別 35 d 49 d
蠲痹低劑量組 131.50±34.171) 647.03±171.761)
蠲痹中劑量組 227.26±39.311) 284.74±30.111)3)
蠲痹高劑量組 42.19±41.641)2) 1 34.68±43.791)3)
甲氨蝶呤組 156.48±72.701) 668.19±104.991)
模型對照組 575.93±10.34 1 433.16±95.15
空白對照組 33.18±6.151)2) 23.08±1.381)3)
注 與模型對照組同期比較，1)P < 0.01;與甲氨蝶呤組同期比較，2)P < 0.05，3)P < 0.01
3.5 溫陽散寒除濕法對CIA大鼠滑膜組織炎癥的影響
3.5.1 CIA大鼠滑膜組織病理觀察 見圖2。
模型對照組(49 d) 空白對照組(49 d)
圖2 大鼠滑膜組織病理光鏡切片(HE染色×200)
3.5.2 各組CIA大鼠35 d、49 d滑膜組織炎癥評分比較 CIA大鼠滑膜組織炎癥評分，35 d時，各組與模型對照組比較，差異無統計學意義(P > 0.05);49 d時，蠲痹中劑量組在改善滑膜組織炎癥評分上優于模型對照組，差異有統計學意義(P < 0.05)，蠲痹高劑量組明顯優于模型對照組，差異有統計學意義(P < 0.01)。見表4。 (下轉第42頁)
(上接第19頁)
表4 各組CIA大鼠35 d、49 d滑膜組織炎癥評分比較 分，
組別 35 d 49 d
蠲痹低劑量組 2.40±3.36 4.20±3.35
蠲痹中劑量組 5.00±2.92 3.60±2.071)
蠲痹高劑量組 1.60±1.95 2.40±1.672)
甲氨蝶呤組 3.60±2.41 4.80±2.78
模型對照組 5.00±2.00 8.00±0.00
空白對照組 0.50±0.71 0.33±0.582)3)
注 與模型對照組同期比較，1)P < 0.05;2)P < 0.01;與甲氨蝶呤組同期比較，3)P < 0.05
4 討 論
蠲痹顆粒是著名中醫學家吳佩衡學術繼承人、云南省名老中醫吳生元教授基于扶陽理論，總結出治療RA的有效良方，具有溫經散寒、祛風除濕、通絡止痛之功，主治寒濕痹阻之RA。近6年來，蠲痹顆粒使用范圍擴大到云南中醫醫療集團54家醫院近1 000例RA患者，顯示了良好的臨床療效，且無明顯毒副作用，倍受廣大RA患者歡迎。
臨床研究顯示，蠲痹顆粒能明顯改善RA活動期的臨床癥狀，降低C-反應蛋白、紅細胞沉降率、類風濕因子等實驗室指標，有效率占82.5%[3]。前期實驗研究表明，蠲痹顆粒不僅具有明顯的抗炎、免疫抑制作用，而且對大鼠佐劑性關節炎及小鼠膠原誘導性關節炎具有顯著的治療作用[4-6]。本次研究亦提示，蠲痹顆粒能對抗膠原誘導性關節炎大鼠的炎癥病變進展，減輕滑膜炎癥，其治療作用可能與抑制相關炎癥因子分泌、釋放有關，相關作用機制有待進一步深入研究。
5 參考文獻
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SCISSCIAHCI
