發布時間：2016-05-18所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 論文摘要：軟骨退變是OA的主要病理特征，是多因素綜合作用引起的軟骨細胞、軟骨基質及軟骨下骨降解與合成偶聯失衡的結果。膠原和蛋白多糖是軟骨細胞外基質的主要成分，Ⅱ型膠原是軟骨基質的特征性膠原成分，構成軟骨內的纖維網架結構;蛋白多糖能吸引大量的水
論文摘要：軟骨退變是OA的主要病理特征，是多因素綜合作用引起的軟骨細胞、軟骨基質及軟骨下骨降解與合成偶聯失衡的結果。膠原和蛋白多糖是軟骨細胞外基質的主要成分，Ⅱ型膠原是軟骨基質的特征性膠原成分，構成軟骨內的纖維網架結構;蛋白多糖能吸引大量的水分子形成凝膠，保持軟骨的膨脹能力和良好彈性。本文選自：《中國傷殘醫學》的原名是《傷殘醫學雜志》，《傷殘醫學雜志》創刊于1993年，原衛生部陳敏章部長、顧英奇副部長為創刊題詞，在有關領導、各位編委、專家、作者、讀者及廣大醫務工作者大力支持和幫助下，學術水平和編校質量不斷提高，2006年經國家新聞出版署批準，更名為《中國傷殘醫學》，由衛生部主管，本刊由省級升格為國家級期刊。
引言
骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種以軟骨退變、骨質增生及軟骨下骨重建異常為特征的慢性骨關節病，易反復發作，纏綿難愈。隨著年齡增加發病率逐漸增加，嚴重影響患者的生活質量，已成為嚴重的公共健康問題[1-2]。目前，OA治療方法雖多，但主要以對癥治療為主，尚缺乏特效療法。為此，尋找一種經濟、方便、無創的有效療法，成為醫學界的共識。
中藥復方治療OA具有療效可靠、價格低廉、副作用小的獨特優勢。補腎壯筋湯是《傷科補要》中治療肝腎虧虛型OA的經典方，具有補益肝腎、強壯筋骨作用[3]，療效顯著。本研究以OA大鼠動物模型為研究對象，探討補腎壯筋湯抑制OA軟骨退變的作用機制。
1 實驗材料
1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠40只，8周齡，雄性，體質量220～250 g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供合格證號：SCXK(滬)2007-0005。福建中醫藥大學實驗動物中心提供清潔級實驗動物環境設施(合格證號：醫動學第23-016號)。實驗動物的處置按照2006年科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》規定。
1.2 藥品、試劑與儀器 補腎壯筋湯(藥物組成：熟地黃12 g、當歸12 g、牛膝10 g、山萸肉12 g、茯苓12 g、續斷12 g、杜仲10 g、白芍10 g、青皮5 g、五加皮10 g)由福建中醫藥大學國醫堂提供;鹽酸氨基葡萄糖膠囊，批號HC20090009，香港澳美制藥廠生產。質量分數10%水合氯醛，批號SF0341，上海士鋒生物科技有限公司生產;木瓜蛋白酶，批號107147，sigma公司生產;蘇木精-伊紅(HE)，批號 G1120，北京索萊寶科技有限公司生產;番紅O-固綠，批號DB0082，北京雷根生物技術有限公司生產;基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)，批號fk1653Y，白細胞介素-1β(IL-1β)，批號fk1588Y，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，批號fk1721Y，透明質酸(HA)，批號fk2052Y，上海滬宇生物科技有限公司生產。ELX808U型酶標儀，美國寶特公司生產;TGL-16G型離心機，上海安亭科學儀器廠生產。
2 方 法
2.1 補腎壯筋湯水提物制備 取干燥、粉碎的補腎壯筋湯方藥粉末105 g，加入1 050 mL的蒸餾水，提取2次，每次2.5 h，趁熱過濾，濃縮，50 ℃真空干燥至恒重。
2.2 實驗方法 SD大鼠40只，按隨機數字表法分為正常組(10只)和造模組(30只)。造模組第1，4，7天，采用質量分數10%水合氯醛3 mL·kg-1
腹腔麻醉，采用質量分數4%木瓜蛋白酶0.2 mL雙膝關節腔注射建立OA模型[4]。造模2周后按隨機數字表法分為模型對照組、補腎壯筋湯組、陽性對照組，每組10只。各組給藥劑量按照人和動物藥物等效劑量換算[5]，已知A種動物每千克體質量用藥量，求出B種動物每千克體質量用藥劑量的換算公式，B種動物的劑量(mg)= A種動物的劑量(mg·kg-1)×
W(折算系數6.25)×B種動物的體質量(kg)。正常組常規喂養，模型對照組以等量生理鹽水灌胃，補腎壯筋湯組以補腎壯筋湯10.5 g·kg-1·d-1
灌胃，陽性對照組予以鹽酸氨基葡萄糖膠囊溶液
150 mg·kg-1·d-1灌胃，每日1次，持續給藥12周。干預12周后，取雙膝關節股骨髁，質量分數4%多聚甲醛固定，常規脫鈣、包埋和切片，分別采用HE、番紅O-固綠染色，觀察軟骨組織形態的變化。參考Mankin's OA組織學分級方法進行評分[6]。軟骨退變程度計分依據表層軟骨細胞分裂增生(0～3分)、細胞排列(0～3分)、潮線(0～3分)、血管翳樣物生成(0～3分)、AB-PAS染色(0～4分)，最高為16分。
2.3 檢測方法
2.3.1 HE染色 切片常規脫蠟，蘇木精染液染色4 min，質量分數1%鹽酸酒精分化液分色10 s，伊紅染液染色3 min，脫水透明封片，觀察軟骨形態結構的變化。
2.3.2 番紅O-固綠染色 切片常規脫蠟，新鮮配制的試劑，Weigert蘇木素染液染色3 min，鹽酸乙醇分化液分化15 s，蒸餾水洗1 min;固綠染色液內浸染5 min，蒸餾水洗1 min;番紅O染色液內浸染
2 min，蒸餾水洗1 min;用乙酸溶液洗滌切片1 min，脫水透明封片，觀察軟骨基質蛋白多糖含量的變化。
2.3.3 ELISA法檢測關節液的生化指標 采用質量分數10%水合氯醛3 mL·kg-1腹腔麻醉，抽取雙膝關節液。抽取前先注射2 mL生理鹽水，反復活動膝關節后，抽取0.8 mL關節液，-80 ℃保存。關節液中MMP-3、IL-1β 、TNF-α、HA含量采用ELISA法檢測。檢測過程嚴格按照試劑說明書的操作步驟，標準曲線的相關系數為0.995。
2.4 統計學方法 采用SPSS l3.0軟件進行統計分析。計量資料以表示，多組數據之間比較采用單因素方差分析，兩組數據之間比較采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。
3 結 果
3.1 補腎壯筋湯抑制OA的軟骨退變 正常組軟骨表面光滑平整，四層結構清晰，軟骨細胞排列整齊，潮線清晰完整，軟骨下骨的骨小梁密度和寬度適中，排列規律，骨細胞呈梭形，分布均勻，見圖1(1)、圖1(2)。模型對照組軟骨表面粗糙，四層結構不清晰，軟骨細胞排列紊亂，潮線模糊、多重或中斷，軟骨下骨囊變、骨小梁稀疏，見圖1(3)、圖1(4)。補腎壯筋湯組、陽性對照組軟骨、軟骨下骨的改變，介于正常組與模型對照組之間，見圖1(5)、圖1(6)、圖1(7)、圖1(8)。
3.2 補腎壯筋湯抑制軟骨基質的蛋白多糖含量減少和纖維變性 正常組軟骨基質中蛋白多糖呈現紅染，膠原纖維呈綠色，軟骨下骨的骨小梁呈綠色，見圖2(1)、圖2(2)。模型對照組軟骨基質中蛋白多糖呈淡紅色，染色范圍減少，而綠色范圍增大，提示軟骨基質中蛋白多糖含量減少，纖維成分增多，見圖2(3)、圖2(4)。補腎壯筋湯組、陽性對照組軟骨基質中蛋白多糖與膠原纖維的變化，明顯好于模型對照組，見圖2(5)、圖2(6)、圖2(7)、圖2(8)。
3.3 補腎壯筋湯降低OA軟骨退變的程度 軟骨Mankin's評分，模型對照組(11.17±2.32)分、補腎壯筋湯組(8.50±2.07)分與陽性對照組(8.33±
1.63)分，明顯高于正常組的(1.83±0.75)分，補腎壯筋湯組
陽性對照組明顯低于模型組(P < 0.05)，補腎壯筋湯組與陽性對照組差異無統計學意義
(P > 0.05)，見圖3。
注 與正常組比較，1)P < 0.01;與模型對照組比較，
2)P < 0.05
3.4 補腎壯筋湯降低炎性細胞因子的含量與增強HA的含量 關節液中IL-1β、TNF-α、MMP-3含量，模型對照組、補腎壯筋湯組與陽性對照組明顯高于正常組(P < 0.01)，補腎壯筋湯組與陽性對照組明顯低于模型組(P 0.05)，補腎壯筋湯組與陽性對照組差異無統計學意義(P > 0.05)，見圖4(1)、圖4(2)、圖(3)。關節液中HA含量，模型對照組、補腎壯筋湯組與陽性對照組明顯低于正常組
(P < 0.01)，補腎壯筋湯組與陽性對照組明顯高于模型對照組(P < 0.05)，補腎壯筋湯組與陽性對照組差異無統計學意義(P > 0.05)，見圖4(4)。
(1) 各組關節液中IL-1β含量
(2) 各組關節液中TNF-α含量
(3) 各組關節液中MMP-3含量
圖4 各組關節液中IL-1β、TNF-α、MMP-3及HA含量
注 與正常組比較，1)P < 0.01;與模型對照組比較，2)P < 0.05
4 討 論
OA疼痛病機分為虛實兩類，肝腎虧虛、氣血虛弱，則筋骨失養，即不榮則痛，屬虛證;風寒濕邪侵襲，則經絡氣血瘀阻，即不通則痛，屬實證。軟骨下骨屬中醫學“骨”范疇，關節軟骨、韌帶、滑膜、關節囊屬中醫學“筋”范疇。軟骨下骨囊變、軟骨退變屬于痿證，以肝腎虧虛為病理特點;骨贅形成、滑膜炎癥屬于痹證，以脈絡瘀滯為病理特點。OA核心病機為本痿標痹，病在筋骨，病位在肝腎，肝腎虧虛，筋骨失養而為痿，腠理空虛易感風寒濕之邪而為痹[7]�；贠A本痿標痹的病理特點，治以補腎柔肝為主(治痿)，輔以祛風除濕散寒(治痹)。補腎壯筋湯以熟地黃、山萸肉補益肝腎，填精補髓，為君藥;續斷、杜仲、五加皮助君藥補益肝腎，強筋壯骨，祛風除濕，為臣藥;當歸補血活
血，白芍斂陰和營、柔肝止痛，茯苓健脾和胃、化痰除濕，青皮行氣疏肝，共為佐藥;牛膝補益肝腎，強筋壯骨，活血通經，引火(血)下行，使方中諸藥直達病所，為使藥。諸藥合用，共奏補腎柔肝、祛風除濕散寒之功效，長期用于肝腎虧虛型OA的治療，療效顯著[3]。
軟骨退變是OA的主要病理特征，是多因素綜合作用引起的軟骨細胞、軟骨基質及軟骨下骨降解與合成偶聯失衡的結果。膠原和蛋白多糖是軟骨細胞外基質的主要成分，Ⅱ型膠原是軟骨基質的特征性膠原成分，構成軟骨內的纖維網架結構;蛋白多糖能吸引大量的水分子形成凝膠，保持軟骨的膨脹能力和良好彈性。OA時，軟骨基質結構發生破壞，以Ⅱ型膠原和蛋白多糖的破壞為主，出現膠原的變性與裂解，蛋白多糖含量下降，引起軟骨細胞功能改變，導致基質成分的合成減少，從而加速軟骨退變[8-9]。本研究HE、番紅O-固綠染色結果顯示，補腎壯筋湯通過抑制軟骨基質中蛋白多糖含量的減少和膠原纖維的變性，延緩OA的軟骨退變。
炎癥反應介導的軟骨基質降解是引起OA軟骨退變的關鍵因素，也在OA的病理過程中發揮重要的調控作用。細胞因子是一組多肽類細胞調節物質的總稱，包括白細胞介素、腫瘤壞死因子、生長因子、干擾素、細胞刺激因子等。正常情況下，體內的細胞因子之間存在相互抑制、相互協同的一個復雜調控網絡，維持體內免疫應答的規律進行，保持體內微環境的穩態。在各種刺激因素下，關節內微環境穩態的變化，引起軟骨細胞功能的改變，導致細胞因子表達的失控，產生炎癥反應，從而促進OA的軟骨退變[10-11]。
IL-1β、TNF-α誘導炎癥反應，促進軟骨退變，在OA發病過程中發揮重要的調控作用。IL-1β是軟骨退變和炎癥反應的重要介質，增強MMP-3表達，抑制軟骨基質成分的合成，促進軟骨細胞終末分化，引起軟骨基質穩態失衡[12]。TNF-α不僅參與滑膜炎癥反應，還能抑制蛋白聚糖的合成，促進軟骨基質降解[13]。IL-1β、TNF-α又稱為“前炎癥因子”，TNF-α既可引起前炎癥反應，又能有效調節IL-1β的表達，且可啟動OA細胞因子的級聯反應，刺激滑膜細胞與軟骨細胞產生MMP-3，加速軟骨基質降解[14-15]。HA帶有負電荷，填充在軟骨細胞與膠原纖維之間，具有保護軟骨細胞，穩定膠原網狀結構，從而維持軟骨的力學特性。在OA病理過程中，HA含量明顯減少，促進了OA的軟骨退變[16]。本研究結果表明，補腎壯筋湯能有效降低關節液中IL-1β、TNF-α、MMP-3的含量，增強關節液中HA的含量，從而抑制炎癥反應，延緩OA的軟骨退變。
綜上所述，補腎壯筋湯通過降低炎性細胞因子表達，增強HA含量，抑制軟骨基質中蛋白多糖含量的減少和膠原纖維的變性，從而延緩OA的軟骨退變。本研究初步揭示補腎壯筋湯抑制OA軟骨退變的可能作用機制之一，其具體的分子調控機制，有待于更深入的實驗研究。
5 參考文獻
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SCISSCIAHCI
