發布時間：2022-04-12所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要： 近年來，正畸牙移動細胞生物力學領域的研究蓬勃發展。牙周膜在正畸牙移動中的核心地位被廣泛認識和接受。以牙周膜細胞為核心，包括骨髓基質千細胞、成骨細胞、成牙骨質細胞、成肌細胞等的體外研究成為揭示正畸牙移動生物學機制的蕈要手段。體外研究模型從通過基
摘要： 近年來，正畸牙移動細胞生物力學領域的研究蓬勃發展。牙周膜在正畸牙移動中的核心地位被廣泛認識和接受。以牙周膜細胞為核心，包括骨髓基質千細胞、成骨細胞、成牙骨質細胞、成肌細胞等的體外研究成為揭示正畸牙移動生物學機制的蕈要手段。體外研究模型從通過基底形變、重物、液壓、離心等方式對二維培養細胞進行應力加載的傳統方式，發展到建立各種對細胞進行三維培養和應力加載的新型模型。骨改建循環中以成骨分化和破骨生成誘導為主的相關分子表達成為研究的熱點。此外，牙周膜干細胞的細胞力學研究也是極具前景的嶄新方向。
關鍵詞：正畸牙移動;牙周膜細胞;應力;骨改建;細胞培養;體外模型;細胞生物力學
正畸牙移動(orthodontic tooth movement，OTM) 中的生物力學涉及3個層面——宏觀生物力學、組織生物力學和細胞生物力學…。近年來，口腔正畸學從基礎理論到臨床技術各方面的發展可謂日新月異，而其中又以OTM細胞生物力學領域的研究進展尤為矚目。
1、基礎理論的更新和發展
1.1骨轉換的3種方式
骨轉換(bone turnover)，即骨結構的改變，主要通過3種方式實現：成骨(osteogenesis)、骨塑建 (bone modeling)和骨改建(bone remodeling)。“成骨”是骨在軟組織表面形成，通常說來是發生在胚胎發育時期、生長早期和愈合期，分為膜內成骨和軟骨內成骨。“骨塑建”是現有的骨組織表面發生長期、廣泛的骨形成。顱面生長發育以骨塑建為主，造成骨結構的形狀改變或表面的推移(translation)。 “骨改建”是生命過程中不斷發生的，包含一系列細胞事件的修復機制，是維持和修復骨結構完整性的唯一生理機制。骨改建始于改建區破骨細胞的征集和激活，隨后“骨吸收”發生。一定時問后，骨吸收終止，該時期被稱為“逆轉期”。逆轉期后“骨形成”開始，骨吸收所造成的缺損得到修復。人體通過骨改建循環維持鈣穩態和更新骨基質，周期大約為4個月，包括一個較快的骨吸收期和相對較慢的骨形成期。2。。OTM中，張力區表現為廣泛成骨，符合骨塑建模式;壓力區則經歷了骨改建循環，短期內骨量減小(臨床表現為牙周膜間隙增寬和牙松動)，隨后回復到治療前水平。正因為如此，牙槽骨修復期間，在牙周膜和牙齦纖維的共同牽拉下，已經發生移動的牙有迅速復位(即畸形復發)的趨勢。引。
1.2壓應力和張應力
OTM的臨床表現分為3階段：(1)受力最初，幾乎即刻發生的牙移動;(2)延遲期，沒有明顯的牙移動;(3)線性牙移動期舊J。應力一旦施加于牙支持組織幾乎立即便發揮作用，據其效應可粗略分為兩類：壓應力和張應力。有限元研究發現，施加在牙周的應力不能簡單的被解釋為沿著載荷方向上的壓應力或張應力，而且，張應力似乎比壓應力范圍更廣。然而，由于張、壓應力的描述在文獻中已經非常普遍，用它們表述會更加通俗易懂。3 J。傳統的骨應力理論認為，應力刺激增加會導致骨形成，而應力缺乏 (如太空失重環境)則導致骨量減少(osteope. nia)——似乎與OTM中壓力側發生破骨的現象矛盾。對此矛盾有2種可能的解釋：第一，OTM壓應力區除了機械應力轉導外，還有明顯的損傷成分，而后者可以生成炎癥介質，從而產生破壞和吸收的效應;第二，OTM壓力區的骨吸收可以看作是牙周膜正常功能性牽張力降低的結果，而張力區則因為牙周膜纖維的正常受載增強而表現為成骨。至于 OTM的最適力，盡管研究者一直試圖用各種方法去證實它的存在，但目前尚無關于最適力的直接證據。其原因在于，通過臨床途徑解釋最適力，無論是測量牙移動距離、力值大小還是應力分布，從技術上都太過復雜了。
1.3牙周膜的核心作用
正畸治療中，牙周膜是牙受力的第一效應組織。經典理論認為，加載正畸力后，壓力側的牙周膜壓縮，張力側的牙周膜拉伸，引發了一系列分子生物學改變，最終導致壓力側骨吸收和張力側骨形成—— 牙移動由此發生。發生骨粘連(ankylosis)，喪失牙周膜的牙受力后不能移動，也證明了牙周膜在OTM 中至關重要的作用。牙周膜中的主要成分是縱橫交錯的膠原纖維束組成的網架結構，占據了其大部分的空間。除此之外另兩種重要成分是細胞和組織液。牙周膜的空腔充滿了血管來源的組織液。這樣一種充滿液體的連續多孔結構使牙周膜有效的發揮了“減震器”(shock absorber)的功能。咀嚼時牙相互接觸的時間非常短，小于1s，隨著組織液被擠出，牙周膜緩沖了絕大部分壓力。但當受到持續應力，即使是較輕的應力時，一旦牙周膜的組織液被擠出了所在范圍，牙周膜便失去了緩沖能力，從而引發另一種不同的生理反應——相鄰牙槽骨的改建，OTM 正是基于這一原理。牙周膜的主要細胞成分是具有成骨細胞特性的成纖維細胞。由于成纖維細胞是牙周膜中數鼉最多，功能也最重要的細胞，通常所說的牙周膜細胞(pefiodontal ligament cells，PDLCs)即指牙周膜中以成纖維細胞為主的細胞群。PDLCs可以向成骨細胞或成牙骨質細胞分化，后者分別形成牙槽骨和牙骨質。此外，牙周膜中還含有部分上皮細胞和少量干細胞。
2 OTM細胞生物力學研究模型
目前對于OTM細胞生物力學反應的了解積累自培養細胞的體外研究及動物和人的體內研究。早期的體內研究提供了大量真實可信的形態學證據，但對于更深層次的細胞分子事件的探索目前主要依賴于以PDLCs為核心，包括骨髓基質干細胞、成骨細胞、成牙骨質細胞、成肌細胞等的體外研究。
2.1體外應力加載方式
體內細胞受力時，細胞不僅通過特定的“機械.生化”信號傳導途徑對力作出反應，也對胞外基質的變化(組織損傷)產生反應，因此，只有通過體外細胞培養模型才能直接評價應力本身對細胞的作用。在細胞生物力學研究中，如何模擬體內情形，對體外細胞施加恰當的應力刺激并進行精確的控制，一直是眾多學者研究的重點。目前細胞體外應力加載主要有以下幾種方式：
(1)基底形變加力：目前為止，使用最廣的是以基底形變為基礎的加力裝置。其基本原理是通過基底彎曲變形增大或減少其長度，從而使附著于基底生長的細胞被拉伸或壓縮。1991年，Andersen等一1 最早報道了用“圓頂”造成基底形變，對細胞施加最大1%雙軸張應變的方法。此后，許多學者用類似方法對PDLCs施加了張應變或壓應變”剖。近年來，基于基底膜形變對細胞施加周期性應變的Hexercell 裝置和國內自行研發的Forcel四點彎曲加力裝置‘瑚J，均被廣泛應用于OTM相關細胞力學研究中。
(2)重物加力。2002年，Kanzaki等∽。報道了采用重物直接對PDLCs加力的方法。他們使用玻璃容器，裝上鉛珠，置于平層培養的PDLCs上，通過改變玻璃容器里鉛珠的數量調節施加壓應力的大小。由于該加力方法產生的持續靜壓力與體內正畸過程中壓力側牙周膜受力的形式極為接近，有不少學者。1圳繼續沿用了這-an力方法，特別是在應力誘導破骨細胞生成的相關研究中。
(3)液壓加力。Yousefian等¨1‘發明了一種可以施加正、負靜液壓的加力裝置，對PDLCs施加了正、負30—600 g/cm2的應力。正靜液壓為壓應力，負靜液壓可以看作張應力，但與前述兩種加力方法產生的張、壓應力從本質上有一定區別�？赡苁怯捎谠摷恿Ψ椒ㄌ^獨特，此后相關研究中的應用較少。國內，張惠等¨2。使用類似的高壓裝置給PDLCs 施加靜液壓，并認為該裝置能施加更大的壓力(約 300—900 g/'cm2)，與咀嚼力值更為接近。近年來，筆者¨川。自行設計的靜液壓加載裝置被廣泛應用于骨髓基質干細胞的力學實驗中。
(4)離心加力。離心力也被認為是一種壓應力。有學者¨o用水平微板轉盤對培養的PDLCs施加持續離心力。在相關研究中，33.5 g/cm2的離心力被用來模擬臨床上的正畸力值。筆者使用改良的離心力加載裝置對成骨細胞的力學信號轉導進行了研究㈦。
通過以上裝置，可以根據實驗需要施加靜態或動態、不同大小、頻率、時長的應力。種類繁多的體外加力方式正說明了體內環境的復雜性，以及體外模擬體內的困難性。目前看來，每種裝置各有優缺點，沒有一種裝置能完全涵蓋體內細胞所處的復雜應力環境。當然，體外實驗首先是一種趨勢性研究，只要保證各加力組中力的加載和傳導保持穩定可重復，就基本滿足了研究需要。
2.2體外應力加載大小
除了加力方式，加力大小也是需要考慮的重要因素。然而，由于加力方式、加力裝置的差異，各實驗中使用的力值，甚至描述力值的單位都不盡相同。不論采用哪種加力方式，力學刺激要激發細胞生物學反應都需要一定的大小，即需超過最小闞值。只有力學刺激達到一定閾值，力學傳感器才會激活;另一方面，力值不能過大，過大的力值會導致大量細胞死亡、脫落。因此，體外實驗中同樣存在理論上的 “最適力”。
對于壓應力有學者傾向于直接以所施應力值描述，單位為g/cm2。用重物加力一J，PDLCs所能承受的力值較小，在5 g/cm2內;而用液壓加力¨¨，壓應力值可高達600 g/cm2。Redlich等¨虬的研究認為，人PDLCs受到1679的離心力最接近臨床正畸加力，相當于施加33.5 g/cm2的持續壓力。對于張應力，研究中通常以應變量而非應力值描述。應變是應力的結果，數值為物體在應力作用下發生的形變量與物體原始長度的比例。實測青少年兒童在外力作用下的牙齒動度，發現給人中切牙施加500 g水平向力時，牙齒切端移動281斗m。設牙周膜寬度為350斗m，計算得出牙槽嵴處牙周膜拉伸約23%，且愈接近牙齒旋轉中心，拉伸率越小。 Yamaguchi等¨7。據此認為9%～24%的應變范圍模擬了牙周膜在創傷以及正畸等非生理狀態下的受力結果。趙志河等[1引采用膜式動態張應力加載裝置選用的最大張應力值為5 kPa，其產生的細胞培養生物膜形變率約為14%。
2.3三維培養應力加載模型
現有體外模型幾乎都是對二維平層培養的細胞進行力學加載。然而，二維培養與體內環境中的細胞對力學刺激的反應有很大差異¨9|，其研究結果不能反映體內三維狀態生長細胞的真實情形。例如，采用“重物法”對二維平層培養的PDLCs加力時，力值不能超過5 g/cm2，否則PDLCs會死亡㈣o;而在正畸治療中，PDLCs實際承受的壓應力約為509/cm2，遠大于該力值。又如，Kanzaki等一1對PDLCs施加持續壓應力后，將其與破骨前體細胞直接共培養，但培養3周后方有破骨細胞生成。如此緩慢(3周)的破骨細胞生成速度與體內情況完全不符——在體內，加力僅2—3 d后即有破骨細胞生成一1。。
可見，現有體外研究模型存在較多的局限與不足，亟需建立更為有效、可靠的新型體外模型。近年來，隨著組織工程技術的發展，以細胞在生物材料中三維培養為基礎建立的新型組織模型成為日益升溫的研究熱點。2007年，兩個實驗室日Ⅻ。先后報道用膠原凝膠三維培養PDLCs，對其施加持續壓應力——可以看作建立“壓應力一牙周膜”三維模型的初步嘗試。2009年，Berendsen等Ⅲ。報道在塑料牙根和塑料頜骨間放置包埋了PDLCs的膠原凝膠，通過“牙根”軸向間隙性移動模擬咀嚼力——可以看作建立“咀嚼力.牙周膜”三維模型的初步嘗試。
在此基礎上，筆者【2糾用聚乳酸一乙醇酸共聚物 (poly(1actic—CO—glycolic acid)，PLGA)支架進行 PDLCs的三維培養，建立了人牙周膜組織模型，并發現持續壓應力作用下該模型中有一系列破骨生成誘導因子表達，證實該模型可模擬體內牙周膜的生物力學反應。此外，筆者。8’一’還將PLGA與四點彎曲加力裝置結合，建立了三維培養成肌細胞周期性張應力加載模型。
3成骨分化和破骨生成誘導分子表達
大量文獻報道了應力作用下體外培養PDLCs 的分子表達，其中成骨分化和破骨誘導分子的表達對于骨改建循環尤為重要。
3.1成骨分化分子
PDLCs在應力刺激下發生分化并產生骨基質，具有明確的時間序列細胞特異性基因調控。成骨相關基因的表達是細胞數量增加的10—20倍，證明機械性成骨反應的主因是細胞分化及功能的增強，而非細胞增殖。此外，體內牙周組織在應力下的成骨向分化進程比體外模型中快數倍，也表明體內環境中機械應力是通過作用于處于預備狀態的成骨前體細胞激活成骨反應，不需要先促進細胞的增殖塒J。
本文來源于：《醫用生物力學》Journal of Medical Biomechanics(雙月刊)創刊于1986年，1992年起改為現名。本刊由上海交通大學主辦，中華人民共和國教育部主管，是國內唯一一本公開發行，積極反映醫學生物力學基礎研究與應用研究成果，推動國內外學術交流，促進醫、理、工各學科相互了解和合作為目的學術性刊物。報道內容主要包括醫學生物力學領域中有關固體力學、流體力學、流變學、運動生物力學等方面的研究論文。
Yamaguchi等【171發現周期性張應力作用5 d 后，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的表達下調，并且下調量與張應力大小成正相關。而持續壓應力似乎同樣會導致ALP表達降低舊3。。但另一研究瑚j發現，周期性張應力作用24 h后，ALP的表達上調而OPG的表達下凋。Pavlin等。291報道了體內實驗中張力側的牙槽骨表層骨鈣素、ALP和I型膠原的時間序列表達情況�？偟恼f來，在加力后6 d 中，這3個成骨相關因子的表達都有上調。Wescott 等[3¨對PDLCs施加了周期性單軸張應變，并用re— a1.time PCR芯片檢測了成骨分化及骨代謝相關基因的表達，發現BMP2、BMP6、ALP、SOX9，MSXl和 VEGFA表達上調，而BMP4和EGF表達下調。另外，有學者…報道了離心力作用下Osx(OS— terix)——種前成骨細胞向功能性成骨細胞分化過程中的特異性轉錄因子——在PDLCs中的表達。加載離心力后，轉染了Osx的PDLCs中ALP、骨橋蛋白(osteopontin)和骨涎蛋白(sialoprotein)等成骨標志基因表達都有上調，證明Osx可能在PDLCs的應力誘導成骨通道中發揮重要作用。
另一方面，有學者舊2’用新生小牛牙原代培養成牙骨質細胞，對其施加周期性張應力，發現BSP表達上調。然而，也有學者舊3。使用OCCM-30成牙骨質細胞系，對其加載周期性張、壓應力，發現BSP和 OPN的表達均下調。
筆者Ⅲ。對骨髓基質干細胞施加壓應力后，發現成骨相關因子如Runx2、Osterix、Msx2和Dlx5等表達上調，ERK通路參與了該力學信號轉導。同時，還發現壓應力還能誘導三維培養的骨髓基質干細胞成軟骨向分化013]，p38 MAPK通路參與了該過程。
3.2破骨生成誘導分子
骨的完整性是形成骨的成骨細胞和吸收骨的破骨細胞動態交互作用的結果。骨改建的速率主要由成骨細胞系決定，除了骨形成外，它們還負責破骨前體細胞的激活和募集。成骨細胞與破骨細胞之間的作用機制一直不清楚——直到發現了成骨細胞表面細胞因子RANKL。RANKL與破骨前體細胞表面的 RANK受體結合，誘導破骨細胞生成，同時存在 CSF-2的情況下，還能激活破骨細胞的骨溶解效應�？扇苄允荏wOPG能與RANK競爭性結合RANKL，故成骨細胞RANKL與OPG的相對表達被看作是破骨誘導的決定因素。
體外實驗口朝表明，無論靜態或動態壓應力作用下，骨髓基質干細胞中RANKL表達均上調。另一方面，PDLCs也能表達RANKL和OPG。體內實驗‘2列發現，RANKL在受力牙的壓力側牙周膜表達顯著上調。從正畸的角度看，很可能由于牙槽窩微環境的壓力改變造成了RANKL和OPG基因表達的改變，從而導致最終的骨改建效應。Kanzaki等‘9。報道持續壓應力作用下，PDLCs中RANKL、COX.2、 PGE2的表達均上調，而OPG的表達沒有變化。國內相關研究m。381結果也與之吻合。Nakajima等啪J 給PDLCs施加了0.5—4.0 g/cm2的持續壓應力，發現RANKL和FGF-2的表達增加，而使用FGF-2抗體可以阻斷RANKL的釋放，提示FGF一2可能在壓應力誘導PDLCs表達RANKL的通路中發揮關鍵作用。Yamaguchi等¨7。發現，牙根吸收的正畸患者來源的PDLCs在壓應力作用下RANKL的表達明顯高于無牙根吸收組來源的PDLCs，提示正畸治療中患者牙根吸收的程度與該患者PDLCs在壓應力作用下產生RANKL的能力強弱有關。
筆者洶。對建立的人牙周膜組織模型施加靜壓應力，當壓應力值>25 g/em2時，RANKL、COX-2，以及一系列破骨生成誘導因子，如胛HrP、IL-8、IL一11、 FGF-2表達上調，且得到體內實驗的進一步印證。
4牙周膜干細胞生物力學
2004年，有學者首次用單克隆培養法從人牙周膜中分離出成牙骨質細胞前體細胞，將其稱為牙周膜干細胞(periodontal ligament stem ceUs，PDLSCs)。隨著我國逐漸進入老齡化社會，牙周病的防治問題顯得尤為突出。近年來干細胞的研究為牙周組織的再生、重建開辟了廣闊的前景。PDLSCs以其組織來源和分化性能的優勢在牙周再生研究中得到越來越多的關注。行使咀嚼、吞咽、言語等各項功能時，以及在正畸治療中，牙周膜均受到不同類型、大小、時長的應力刺激，故應力刺激無疑是影響PDLSCs功能的一種非常重要的微環境因素。然而，目前對于 PDLSCs的生物力學相關研究，包括其力學信號轉導通路、應力敏感基因、應力誘導分化等各方面的研究幾乎還處于真空地帶，存在廣闊、誘人的探索空間。綜上所述，在OTM和牙周修復重建的各階段，不同的應力刺激導致了“細胞一細胞”及“細胞一基質”交互反應。這些反應決定了牙周改建的結局。目前的研究趨勢是弄清以上現象背后的細胞分子機制，擴大對控制骨和牙周膜改建的基因和轉錄因子的認識。關于OTM生物力學反應的理論可以幫助我們認清有效的臨床方法，識別并摒棄有害的力學療法(mechanotherapy)。未來的正畸和牙周修復重建治療也會因此越來越科學合理，越來越有利于患者。——論文作者：趙志河，李宇
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