發布時間：2021-04-29所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:骨髓間充質干細胞在體內所處的力學環境比較復雜，為了探索生物力學與骨髓間充質干細胞增殖分化之間的關系，對近年來生物力學微環境對骨髓間充質干細胞增殖分化影響的研究現狀和最新進展進行了綜述。認為牽張力與流體剪切力對骨髓間充質干細胞產生的刺激
摘要:骨髓間充質干細胞在體內所處的力學環境比較復雜，為了探索生物力學與骨髓間充質干細胞增殖分化之間的關系，對近年來生物力學微環境對骨髓間充質干細胞增殖分化影響的研究現狀和最新進展進行了綜述。認為牽張力與流體剪切力對骨髓間充質干細胞產生的刺激大部分會使其向成骨方向分化，而較大的壓縮力和靜水壓力對骨髓間充質干細胞產生的刺激大部分會使其偏向軟骨方向分化，小部分向成骨方向分化，每種分化方向都有其最適的分化條件。通過綜述生物力學對骨髓間充質干細胞增殖及成骨分化的影響，為骨髓間充質干細胞的骨組織工程與再生醫學研究及更好地應用于臨床治療提供思路和參考依據。
關鍵詞:骨髓間充質干細胞;生物力學;增殖;分化
骨髓間充質干細胞(bonelessmarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是一類具有自我增殖、多向分化潛能的干細胞，具備免疫源性低、方便取材、來源廣泛等優點，常用于細胞組織移植、心血管疾病、骨缺損修復等多個領域[1-2]。研究認為BMSCs在生長過程中可感知不同的生物力學信號，從而影響細胞增殖、成骨分化等功能，而體內BMSCs的生長、成骨分化與骨組織的再生等也離不開復雜的力學作用環境[3-4]。目前已有相關力學對BMSCs影響的研究[5-6]，但采用的力學加載模式、時間、頻率等皆不盡相同，且不同的作用力對BMSCs增殖、分化的影響不同。本文闡述了不同生物力學(牽張力、壓力、流體剪切力)對BMSCs增殖與成骨分化的影響，及其可能作用的基因和信號傳導通路等，為BMSCs的骨組織工程與再生醫學研究及更好地應用于臨床治療提供參考。
1不同牽張力作用對BMSC增殖和成骨分化的影響
牽張力(mechanicaltensionstress，MTS)作為一個重要機械調節因素，對BMSCs起到拉伸應力作用[7]。目前國內外已有多種不同力學加載設備及力學刺激方式，其中研究較多的為牽張力。研究證實牽張力可有效促進細胞活性和功能，在骨再生和骨生物工程的臨床應用中有重要指導意義[8]。但不同牽張力對BMSCs的增殖及成骨分化有不同的影響。
細胞的受力大小是無法測量出來的，只能間接通過硅膠膜的形變率、支撐物的上下運動位移來估計(根據牽拉頭尺寸參數表計算，文中力的強度用百分數來表示)。黎潤光等[9]參考Schaffer建模方法自行建立體外細胞周期性機械牽張力學裝置，在1.0Hz的頻率下，分別采用不同應力大小、不同時間的機械信號刺激，結果表明12%應力作用下增殖指數最高，可達到無應力狀態下的1.86倍，而采用過強的牽張應力(18%)時，對細胞不具有促進增殖效應;同時，牽張力干預早期可以促進BMSCs增殖，干預時間超過48h反而表現為抑制生長狀態。井燕等[10]采用雙軸力學應變系統選取0.4%、1.0Hz頻率、每天3次、每次2h、間隔2h的力學應變加載BMSCs，力學應變作用后細胞增殖指數(proliferationindex，PI)比相應靜態組增高，動物骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)和堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)的表達均有明顯升高，表明力學應變可以提高BMSCs的增殖和成骨分化能力。戚孟春等[11]采用四點彎曲加力系統施加的40min、0.2%機械牽張力作用于大鼠BMSCs，發現受力組在受力后細胞數明顯高于對照組，BMSCs增殖活力顯著增高并短暫性成骨向分化。通過加載機械張力，模擬骨組織受力情況發現，不同大小、時間、頻率的機械張力均影響BMSCs增殖，大小適宜的機械張力可起到促進作用。
高鶯等[12]同樣采用四點彎曲加力系統對SD大鼠BMSCs施加0.2%機械牽張力，結果顯示其細胞生長曲線與對照組相比差別不大，但骨鈣素表達水平和ALP活性顯著增高，且芯片雜交檢測的差異表達基因數量變化明顯。薛令法等[13]采用Flexcell體外細胞力學加載裝置，施加0.5Hz頻率、0.8%形變率、每天2次、每次30min的間歇性牽張力，可促進小鼠BMSCs成骨分化。Wu等[14]通過Flexercell-5000給予人BMSCs機械拉伸(10%，0.5Hz)，數據顯示LncRNAH19通過上調下游FAK來介導牽張力誘導的BMSCs成骨分化。Jang等[15]采用單軸拉伸應力單元系統，分別以3%和10%拉伸力、0.26Hz頻率給予兔源BMSCs循環張力，結果發現張力促進BMSCs增殖增加，并且10%牽張力趨向平滑肌細胞分化，3%牽張力趨向成骨細胞分化。Song等[16]采用自行組裝的機械拉伸裝置以1Hz頻率、2%～8%拉伸15～60min，經MTT檢測后顯示牽張力具有促進BMSCs增殖的重要作用，且采用8%應變、60min拉伸處理的BMSCs細胞c-fos基因表達明顯升高。通過以上研究發現，一定條件的周期性力學信號刺激可以促進BMSCs向成骨方向分化，但當拉伸幅度及作用時間不同時，可出現不同的細胞分化方向。
2不同壓力作用對BMSCs增殖和成骨分化的影響
力學刺激對細胞功能及組織發育、重建等有重要影響作用，BMSCs受到多種應力作用，而壓應力同樣作為正常人體關節運動中的主要受力因素，亦可引起細胞生物力學特性的變化[17]，在研究中對BMSCs施以壓應力(hydrostaticstress，HDS)能很好地模擬細胞的體內環境，同時又易于標準化和結果間的相互比較與分析[18]。
劉巖正等[19]采用自行設計的可控細胞液壓加載裝置給予BMSCs細胞相應的靜壓力刺激，結果表明采用90kPa靜壓力每天1h連續作用2d促BMSCs增殖與成軟骨向分化的作用最顯著，PCNA、SOX-9、AggrecanmRNA的表達均顯著升高。何川等[20]采用自制加壓裝置給予BMSCs加載靜水壓，發現40kPa的靜水壓連續作用4d可以促進Cbfa1、OCmRNA表達，連續作用7d時仍對BMSCs表現為促成骨分化作用，在連續作用14d時，作用轉變為促成脂分化。李正章等[21]采用自行改制的細胞壓力加載裝置進行力學干預BMSCs，結果顯示分別在5.32、10.64、21.28kPa壓力干預下細胞增殖指數均明顯升高，MMP-2活性最低;而在29.26kPa壓力下增殖指數則明顯下降且死亡增多，基質金屬蛋白酶2(Matrixmetalloproteinase-2，MMP-2)活性增高。潘景光等[22]采用自行設計制作的細胞液壓加載裝置對BMSCs經動態壓力處理后，在0～45kPa和0～90kPa動態正壓作用下，BMSCs增殖活性顯著增強，且與壓力值呈正相關。但通過透射電鏡觀察細胞的超微結構發現0～45kPa動態壓力作用下可促進細胞蛋白合成，而在0～90kPa動態壓力作用下，細胞中出現了凋亡小體，證實在該壓力作用下可誘導細胞凋亡。趙永亮等[23]采用Flexcell-5000基底壓縮加載系統對BMSCs延遲性周期性壓縮應力刺激(正弦波、0.5Hz、20kPa、2h/d壓縮應力)，結果顯示應力可促進Col2的表達，抑制ROCK通路，并可能通過ROCK通路調控BMSCs成軟骨分化。易飛舟等[24]采用自主研發的細胞液壓加載裝置，分別對BMSCs加載持續靜壓力45、90kPa及周期性動壓力0～45kPa、0～90kPa。數據顯示90kPa靜壓作用下Sox9及Aggrecan基因的表達量顯著高于0～90kPa，而0～45kPa壓力促Sox9及Col2基因上調的作用則高于45kPa壓力，且在持續90kPa的壓力作用下BMCSs成軟骨分化效果顯著。當對BMSCs加載壓力較小時，壓應力可促進BMSCs增殖且向成骨方向分化，而當壓力增大時BMSCs趨向成軟骨方向分化。
3不同的剪切力作用對BMSCs增殖和成骨分化的影響
骨骼組織中的細胞在生理狀態下，需要一定強度的流體剪切應力(fluidshearstress，FSS)的刺激，使其保持正常的生理功能，同時，培養液的流動也可對所培養的細胞產生流體剪切應力[25]，有研究表明，一定范圍的流體剪切應力可以刺激BMSCs細胞的分化及增殖，保持細胞正常的生理功能[26-27]。
李洪鵬等[28]采用自制平行平板流動腔對BMSCs加載0.3Pa的流體剪切力刺激30min，結果表明流體剪切力可提高BMSCs細胞早期的細胞內ALP含量，細胞開始向成骨細胞分化，但未能促使晚期的骨鈣素表達升高，說明此強度的流體剪切力不能成功促進人BMSCs最終實現向成骨方向分化。李立等[29]將BMSCs置于平行板流動腔內，以0.8Pa切應力條件下誘導24h，發現BMSCs可轉化成內皮細胞。Kreke等[30]以0.16Pa的流體剪切力作用于大鼠BMSCs細胞，在成骨誘導培養液(地塞米松、β-甘油磷酸和抗壞血酸)中培養，在第6、8、10和12d檢測時，流體剪切力促進了骨唾液酸蛋白(Bonesialoprotein，BSP)和骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)的表達，促進了OPN蛋白的積累，抑制了脂蛋白脂肪酶(Lipoproteinlipase，LPL)的表達;在第20d檢測30min的加載力下，OPN及BSPmRNA的表達水平達到最高，同時，持續120min時成脂標志物脂蛋白脂肪酶的表達最少。劉立躍等[31]發現以0.42Pa間歇性FSS培養的BMSCs則向成骨細胞分化明顯，而0.42Pa持續性FSS和0.034Pa的FSS對BMSCs沒有明顯的誘導分化作用。Stavenschi等[32]將BMSCs在封閉環境中分別給予不同剪切力，發現剪切力可以促進成骨標志物Cox2、Runx2和OPN的mRNA表達上調，確定在BMSCs施加2Hz、2Pa、FSS時成骨標志物表達上調最明顯。Huang等[33]發現適當的FSS單獨處理可以使心肌細胞相關標記物的表達顯著增加，誘導BMSCs向心肌細胞轉化。由此可見，BMSCs的增殖和分化與流體剪切力的刺激有密不可分的聯系，較低強度的流體剪切力對BMSCs的影響并不大，較高強度的流體剪切力會抑制細胞的成骨分化。
不同生物力學作用大小、頻率、作用時間等對BMSCs增殖和成骨分化的影響，以及相關的作用基因，如表1所示。牽張力一般在24h內，拉伸幅度為12%以下時，主要通過影響ALP、OPN、COLI、Ets1、Cbfa1、osterix、Runx2等基因，促進BMSCs增殖和成骨分化;壓力范圍在0～90kPa，每日加壓時間在1～6h時，主要通過影響Cbfa1、OC促進BMSCs成骨分化;施加剪切力在0.3～2.0Pa，加載范圍在0.5～2.0h時，主要通過ALP、OC、Runx2、OCN、COLIα等基因，促進BMSCs成骨分化。
4生物力學作用影響BMSCs增殖和成骨分化參與調節的信號傳導通路
細胞感受力學信號，通過信號傳導通路，影響基因的表達和蛋白質的合成[34]，機械刺激通過影響整合素表達，繼而整合素將機械刺激轉換為生物力學信號，實現對BMSCs的成骨分化調控。不同力學刺激BMSCs后，BMSCs的整合素α2β1、α5β1、αVβ3等表達量升高，同時以整合素為基礎的FAK參與啟動多條信號通路，通過調控不同的信號通路，進而促進與成骨分化相關基因表達。由此，多種細胞成分在信號傳導中起到重要的作用，如細胞骨架、整合素、離子通道等方面參與機械力學信號轉導[35]。
Simmons等[36]對人BMSCs施加0.25Hz、3%形變率的牽張力，激活了細胞外信號調節激酶(ERK1/2)和P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，同時發現p38信號通路在BMSCs應變誘導成骨分化的調控中起抑制作用。劉小雅等[37]采用Flexcell細胞力學加載裝置對小鼠BMSCs施加0.5Hz、0.8%振幅的機械牽張力，結果表明在持續牽張力作用下可通過p38MAPK通路向成骨細胞分化。由此可見，小幅度的牽張力能通過p38MAPK信號通路促進BMSCs成骨分化。趙闖等[38]通過自行研制的細胞加載裝置對BMSCs施加機械張應力0.25%、加力60min，提示牽張力加載激活了Wnt信號3個關鍵分子Wnt3A、β-catenin與Lef-1，并刺激BMSCs增殖與骨向分化過程。另有研究者用Flexcell應變裝置對大鼠BMSCs給予機械張應力10%、0.5Hz頻率，每日2次循環拉伸刺激，通過短干擾RNA下調Cbfa1基因表達后，成骨標記物表達出現下降，證明了牽張力刺激可能通過ERK1/2激活的Cbfa1信號通路促進大鼠BMSCs成骨分化[39]。同時，研究表明整合素FAK信號通路參與了機械牽張誘導BMSCs成骨分化的調節，整合素介導的FAK活化后，Ras-Raf-MAPK/ERK、FAK-PI3K-Akt等信號通路可能進一步激活，調控細胞功能[40]。
杜靜等[41]采用自主研發的靜態液壓加載裝置對兔BMSCs加載120kPa、每天1h、連續4d的力學刺激，結果顯示壓力刺激后，BMP2及Smad1/Smad5表達明顯上調，同時促進BMSCs軟骨方向的分化。陳驥等[42]采用自行設計制作的可控細胞液壓加載裝置給予90kPa壓強加載1h，提示壓力可以通過激活RhoA的活性可促進DNA合成及細胞增殖，并在成骨誘導早期，依賴RhoA活性，壓力可促進BMSCs成骨分化，而在成骨誘導晚期，RhoA活性抑制，OPN下調，壓力對成骨分化晚期起抑制作用。另有研究者采用可控細胞液壓加載裝置對大鼠BMSCs施加90kPa流體靜壓力，結果顯示BMSCs中Sox9、Aggrecan及ColII的mRNA表達量增加，且Rac1在流體靜壓力導致的細胞成軟骨分化過程中亦具有調控作用[43]。此外，靜水壓力還可通過Wnt-RhoA-ROCK調節BMSCs，進而影響早期成骨分化標志物基因的表達[44]。
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研究者使用平行板培養箱研究剪切應力對人BMSCs成骨分化的調節能力，結果顯示在1.2Pa的流體剪切應力作用下，在一段時間內對Cbfa1/Runx2基因的表達有影響，而BMSCs的成骨活性迅速增強，I型膠原基因的表達下降，這些效應依賴于p38和ERK1/2的激活[45]。同時，Liu等[46]證實通過信號通路，間歇性流體剪切力可以誘導人BMSCs成骨分化。首先β1整合素感知細胞外間歇性FSS的刺激后，通過激活FAK活化ERK1/2導致Runx2磷酸化，磷酸化的Runx2啟動成骨基因的轉錄，進而促進BMSCs向成骨細胞分化;其次，間歇性FSS激活的ERK1/2通過激活NF-κB增加BMPs的表達，BMPs的增加導致BMP/Smad通路的激活，最終導致Runx2的表達;再次，間歇性FSS激活的ERK1/2通過介導NF-κB的活化影響β1整合素的表達。——論文作者：曹盛楠1，2a，2b，師彬2a，2b，孫國棟3，4，王從安2a，2b，王丹丹2a，2b*
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