深低溫保存同種異體肌腱的基礎研究進展

發布時間：2021-04-29所屬分類：醫學論文瀏覽：1次

摘 要： 摘要:日常生活中肌腱損傷十分常見，同種異體肌腱移植是肌腱損傷后重建的主要治療手段之一。為了確保移植的最佳質量和安全性，同種異體肌腱的初始處理及保存尤為重要。常見的同種異體肌腱保存方法主要包括冷凍干燥、化學萃

　　摘要:日常生活中肌腱損傷十分常見，同種異體肌腱移植是肌腱損傷后重建的主要治療手段之一。為了確保移植的最佳質量和安全性，同種異體肌腱的初始處理及保存尤為重要。常見的同種異體肌腱保存方法主要包括冷凍干燥、化學萃取、輻照滅菌以及深低溫保存等。生物力學研究對肌腱退行性變或外傷等治療方案的評估具有廣泛的臨床意義，深低溫保存法能夠很大程度地保留肌腱的生物力學特性，維持移植后的抗拉強度和韌性，同時還可以有效消除肌腱免疫原性，減輕與宿主之間的排斥反應，從而保證移植的成功并獲得良好的臨床效果，具有極高的研究價值。

　　關鍵詞:同種異體肌腱;深低溫保存;生物力學;免疫原性

　　肌腱是骨骼與肌肉之間力量傳遞的重要組織，常應對較大的力量負荷，在活動過程中易造成急性損傷，因此在臨床工作中肌腱損傷十分常見。肌腱移植在外科重建和修復治療中的應用十分廣泛，肌腱移植材料需求量也日益增加。目前的肌腱移植材料主要包括自體肌腱、異體肌腱、人工肌腱和組織工程肌腱等，其中同種異體肌腱因來源豐富、供區并發癥少等優點在臨床及科研工作中應用廣泛[1]。移植成功率的提高取決于細胞活性、生物力學及免疫原性等方面。深低溫保存是同種異體肌腱常見的處理方法之一，低溫下能夠對細胞進行加工儲存，保證細胞和組織機構及功能的完整性。但低溫冷凍在一定程度上會破壞細胞，嚴重的細胞應激還可導致不可逆的損傷，通過添加保護劑可以實現有效的緩沖，降低溶液的冰點，避免細胞暴露于有害濃度下，而且保護劑還可穿透細胞膜保護細胞內部結構[2]。同時，在解凍和復溫時，還需要考慮細胞濃度、冷凍保護劑的選擇和濃度以及解凍速率等。在冷凍保存前和冷凍保存后均需評估細胞的活力和功能，以便進一步優化冷凍保存過程[3]。為實現最佳移植效果，需進一步提高對低溫生物學的認識�，F就深低溫保存同種異體肌腱的基礎研究進展予以綜述。

　　1深低溫保存定義

　　深低溫(深低溫冰箱-70～-80℃，液氮-196℃)保存是保持肌腱固有特性的良好儲存手段。低溫可以抑制正常機體組織細胞代謝活動，使其不產生化學反應過程，理論上，在此溫度下的所有生物活動均會停止，包括一些導致細胞死亡的生物化學活動，深低溫保存肌腱可為臨床提供具有細胞活性和彈性良好的供體，且深低溫保存同種異體肌腱移植效果與自體肌腱差異較小[4]。

　　相關知識推薦：綜述類論文怎么降重

　　深低溫保存包括普通程序降溫和玻璃化。普通程序降溫是逐步降溫，而玻璃化保存法是一種采用高濃度冷凍保護劑和單步快速降溫的技術，可使細胞內外同時玻璃化，減少細胞內外冰晶形成造成的滲透性損害。玻璃化是一個動態過程，需要具有較特定閾值更快的冷卻、升溫速率，但這取決于所使用的玻璃化溶液的組成和總濃度。深低溫保存法不僅能夠有效消除肌腱免疫原性，還能很大程度地保留細胞活性，同時維持力學性能。

　　2冷凍保護劑

　　常規的冷卻方案在低溫保存過程中可形成冰晶并增加溶質濃度，溶質濃度升高引起的損害可以通過使用冷凍保護劑來減輕。冷凍保護劑可與細胞內水分結合，防止冷凍過程中細胞內外冰晶的形成，減輕快速結冰帶來的不可逆性細胞損害，同時還可避免細胞脫水引起滲透性增高造成的破壞作用。Sass等[5]用常見的冷凍保護劑二甲基亞砜和甘油低溫保存肌腱，并比較天然肌腱和低溫保存肌腱的生存活力，結果發現，經低溫保存和解凍處理后，肌腱成纖維細胞的增殖能力并未發生顯著變化。Hochstrat等[6]研究發現，使用二甲基亞砜低溫保存肌腱組織可保持細胞活力，而在0.9%氯化鈉溶液中保存的肌腱則無殘留的代謝活性，在冷凍過程中細胞及組織結構被完全破壞。李雯瑛[7]將外周血造血干細胞深低溫保存于二甲基亞砜和羥乙基淀粉保護劑中，細胞存活率高，且回收后外周血造血干細胞在體內能夠快速恢復活性。Isildar等[8]使用二甲基亞砜和10%1，2-丙二醇制備了兩種不同的冷凍保護液用于保存臍帶組織，結果發現，在冷凍保護劑中保存的臍帶組織的形態學和免疫表型與新鮮臍帶組織無顯著差異，同時可分離相似的間充質干細胞，且從10%1，2-丙二醇冷凍保護液中分離的細胞的增殖速率較新鮮組織分離的細胞低，但均可觀察到成骨和成脂分化。由此可知，加入冷凍保護劑的深低溫保存細胞的增殖分化能力良好，與新鮮組織細胞的增殖分化能力的差異較小。同時，冷凍保護劑種類、濃度及配比也會影響保存效果，實際應用中應根據組織及細胞的特性選擇合適的冷凍保護劑。

　　3深低溫保存對同種異體肌腱細胞活力的影響

　　3.1肌腱細胞傳統觀點認為，肌腱僅由肌腱細胞(即肌腱的固有細胞)組成，經深低溫處理后，細胞受損并失去活性，僅發揮生長支架的作用;隨后對自體肌腱愈合機制的深入研究發現，肌腱細胞主動參與內在性愈合過程[9]。由于肌腱細胞內細胞液含量少，深低溫保存時冰晶形成少，因此對細胞器及細胞膜的損傷也較小。孫燕琨等[10]研究表明，與新鮮對照肌腱相比，經深低溫保存的肌腱活細胞的數量有所減少，但形態相似，同時可分裂、增殖并合成膠原纖維。另有研究表明，冷凍解凍后的肌腱細胞數量與新鮮肌腱相近，同時細胞水腫、成纖維細胞增殖等過程也與新鮮肌腱相似[11-12]。楊宇升等[13]研究表明，同種異體肌腱經深低溫保存后早期組織學愈合過程較自體肌腱延遲，但24周后愈合程度與新鮮肌腱基本相同。由此可知，經深低溫保存后，肌腱細胞的活性和數量均受到一定損傷，但仍能生長、增殖并參與愈合過程。

　　3.2肌腱干細胞肌腱由纖維膠原束平行排列組成，組織內血供少，組成的成纖維細胞為成體細胞，代謝較低且自我修復過程緩慢，增殖分化能力也十分有限。與成纖維細胞相比，肌腱干細胞具有獨特的優勢[14]。肌腱干細胞是一種新型細胞，已成功地從人類、小鼠和新西蘭兔肌腱及韌帶組織中分離出來[15-16]。Zhang和Wang[17]研究表明，與肌腱細胞相比，肌腱干細胞具有不同的特性，包括細胞標記表達、增殖和分化潛能以及細胞培養時的形態等方面的差異。體外的肌腱干細胞可分化為脂肪細胞、軟骨細胞及骨細胞;體內的肌腱干細胞可分化形成肌腱、軟骨及骨組織[18]。而肌腱細胞幾乎不存在分化潛能。還有研究發現，與骨髓間充質干細胞相比，肌腱干細胞的增殖更快，可表達更多肌腱相關基因與蛋白，組織學也可較早觀察到膠原纖維束的規則排列，同時具有更豐富的細胞外基質[19]。Ni等[20]研究表明，肌腱干細胞可表達更多的與肌腱分化相關的信使RNA，具有肌腱干細胞的纖維蛋白結構較無肌腱干細胞的結構修復更早進行。可見，肌腱干細胞具有強大的增殖分化能力，在促進肌腱的修復和愈合過程中起關鍵作用。

　　深低溫處理會損傷肌腱干細胞，并對其功能產生一定影響。但Mitchell等[21]研究表明，深低溫保存肌腱干細胞與新鮮肌腱的活力、數量、形態、早期凋亡率、體外遷移能力以及分化能力無顯著差異，解凍后24h的肌腱干細胞仍處于原代，而解凍72h后的大部分肌腱干細胞處于第四代增殖。因此，肌腱干細胞在肌腱損傷修復過程中極其重要。肌腱干細胞具有與正常細胞相似的生長、增殖和代謝過程，能夠定向分化為肌腱細胞，分泌膠原纖維，維持完整的肌腱結構，從而發揮正常的生理功能，進一步促進肌腱損傷的愈合[22]。

　　4深低溫保存對同種異體肌腱生物力學性能的影響

　　肌腱的主要功能是力量傳遞，因此肌腱移植術后的抗拉強度和韌性是決定手術成敗的關鍵因素之一。目前暫未對深低溫保存中肌腱的生物力學性能的損傷達成共識。有學者認為，深低溫保存對肌腱生物力學性能無影響[12，23-24]。Lee和Elliott[25]研究表明，雖然冷凍可以改變肌腱的微觀結構，但在肌束和纖維水平上，新鮮肌腱與冷凍肌腱的所有參數比較差異均無統計學意義，表明冷凍對肌腱力學無影響，不會引起相應的機械或結構變化。Chen等[26]認為，新鮮冷凍的伸肌腱是伸肌機制重建的可行選擇，盡管同種異體肌腱的細胞活力偏低，但其生物力學性能顯著恢復。Negrín等[27]在重建內側髕韌帶的生物力學研究中發現，同種異體肌腱移植承受的最大拉伸力、剛度和伸長率等足以使其在體內進行重建并發揮正常功能。然而，有部分研究認為深低溫保存可導致肌腱的結構及生物力學性能發生顯著變化。如Giannini等[28]將22例深低溫處理的脛骨后肌腱與新鮮對照肌腱進行比較發現，經深低溫處理肌腱的極限荷載、極限應力以及極限應變均較新鮮肌腱有所降低，對肌腱力學性能有一定影響。Lansdown等[29]研究發現，在冷凍保存過程中，冷凍溫度、冷凍介質種類及濃度以及多次凍融循環，可以改變結構特性，并導致不同的生物力學結果�？梢姡�深低溫保存過程中多種因素會對力學性能產生影響。

　　4.1冷凍溫度與常溫相比，低溫可通過抑制代謝和顯著延緩離體組織儲存過程中降解的生理過程來穩定生物結構。Hohmann等[30]研究表明，無論冷凍或解凍的溫度如何，冷凍后肌腱的機械性能均會發生一定變化，低溫保存后，肌腱彈性增大。Oswald等[31]發現，經液氮處理肌腱的蠕變應變和初始破壞應變均顯著提高，且最大應變顯著降低。因此，在低溫保存前對肌腱進行快速冷凍可降低肌腱的負荷能力。與極低冷凍溫度下的低溫保存類似，經液氮處理的肌腱損傷可能由迅速降溫的冷凍過程引起。因此，在同種異體肌腱移植的滅菌過程中，由于可能對肌腱性能產生負面影響，故不應使用液氮處理。緩慢、溫和的凍存過程可減少冰晶形成，而冷凍溫度的影響可能與液體丟失、滲透性改變以及其他物理損傷相關。評估反復冷凍和解凍溫度的研究顯示，冷凍對肌腱性能無影響[32]。

　　4.2冷凍介質在目前的冷凍保存方法中，0℃以下組織及器官結構不受控制的冰晶形成是唯一最關鍵的因素，嚴重限制了冷凍和解凍過程中的儲存效果。低溫保存通常置于磷酸鹽緩沖液中，不添加任何低溫保護劑[33]。Chen等[34]研究表明，等滲緩沖溶液保證了細胞處于流體狀態時的活力。冷凍可導致冰晶形成，破壞肌腱細胞和細胞外基質，使生物力學性能發生改變，而通過使用基于玻璃化的無冰冷凍保存技術可以較好地解決冰晶形成的問題。Hochstrat等[6]研究表明，二甲基亞砜對肌腱細胞和細胞外基質具有積極作用，與磷酸鹽緩沖液中儲存的肌腱相比，二甲基亞砜儲存可以增強肌腱的生物力學特征;二甲基亞砜在冷凍過程中保持了肌腱細胞的活力，電鏡下，磷酸鹽緩沖液凍存肌腱的膠原纖維形態更不規則，而二甲基亞砜凍存的肌腱則保留了膠原結構。肌腱組織中主要為Ⅰ型膠原，Ding等[35]證明，凍融使膠原蛋白溶液形成微孔結構，孔隙主要被水填充，在凍結過程中，微孔結構變得更小、更有規則，導致膠原結構發生變化，而使用二甲基亞砜作為保護劑可以減少膠原結構變化。加入冷凍保護劑可以減少低溫帶來的冰晶損傷，使低溫保存肌腱的結構與新鮮肌腱更接近，以維持正常的生物力學性能。

　　4.3凍融循環新鮮冷凍是同種異體移植最常用的保存方法，與單次凍融循環相比，重復經歷多個周期凍融對人肌腱的生物力學性能有一定影響。多次凍融循環會改變肌腱結構特性，導致生物力學性能變化[29]。Suto等[36]研究表明，反復的凍融循環會降低骨和肌腱結構中骨細胞的存活率，但不會影響肌腱的機械性能。Hochstrat等[6]表明，新鮮肌腱與冷凍一次的肌腱具有相似的動態楊氏模量。應用兩個以上的凍融循環可能加劇肌腱組織的損傷，顯著降低其最大負荷[25]。黃洪杰等[37]研究證實，凍融周期應少于3次，反復凍存復溫會加劇肌腱組織損傷，使其易發生斷裂。Chen等[34]研究表明，反復凍融可改變新西蘭兔跟腱的組織結構，使跟腱的最大負荷、最大負荷能量和最大應力等部分生物力學性能顯著降低。Arnout等[38]研究表明，3個周期內的凍融循環對生物力學性能無影響。相比之下，多次凍融循環削弱了同種異體肌腱移植的生物力學性能，使移植物更容易疲勞，甚至斷裂[37]。

　　深低溫保存對肌腱生物力學的影響與多種因素有關，包括冷凍溫度、冷凍介質、凍融循環以及凍存時間、個體差異等。深低溫在維持細胞代謝的同時也會對力學性能造成負面影響。針對不同個體及不同部位的移植要求，在保證功能的前提下盡可能多地保留肌腱力學特性。——論文作者：張佩，王成，楊軍