發布時間：2021-04-25所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要目的:探究熱休克蛋白47(HSP47)siRNA對體外培養人眼Tenon囊成纖維(HTCF)細胞生物學行為及轉化生長因子-1(TGF-1)表達水平影響。方法:體外培養HTCF細胞，并分為:空白對照組、空載體組和轉染組;轉染組根據HSP47基因序列設計并合成干擾siRNA序列，構建載體并
摘要目的:探究熱休克蛋白47(HSP47)siRNA對體外培養人眼Tenon囊成纖維(HTCF)細胞生物學行為及轉化生長因子-β1(TGF-β1)表達水平影響。方法:體外培養HTCF細胞，并分為:空白對照組、空載體組和轉染組;轉染組根據HSP47基因序列設計并合成干擾siRNA序列，構建載體并導入HTCF細胞中;空載體組導入空白載體。采用RT-PCR和蛋白質印跡實驗檢測細胞中HSP47mRNA和蛋白的表達情況，采用克隆形成實驗、流式細胞術、Transwell法及劃痕實驗檢測細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移，蛋白質印跡實驗檢測增殖、凋亡、侵襲、遷移蛋白和TGF-β1的表達情況。結果:相比空載體組，轉染組HSP47mRNA和蛋白的表達、克隆形成率、細胞愈合率、侵襲細胞數目、Ki67、N-cadherin、TGF-β1蛋白相對表達水平顯著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白相對表達水平顯著升高(P<0.05)，但細胞凋亡率、Bcl-2和Bax蛋白相對表達水平均無差異(P>0.05)。結論:HSP47siRNA可以通過抑制TGF-β1蛋白的表達降低HTCF細胞的增殖、侵襲及遷移能力，但對HTCF細胞的凋亡無明顯影響。
關鍵詞:熱休克蛋白47;人眼Tenon囊成纖維細胞;轉化生長因子-β1
0引言
青光眼是常見的致盲眼病，目前主要采用青光眼濾過手術治療[1]。但手術操作會促進手術周圍組織中成纖維細胞的增生，致使濾過通道閉合，導致青光眼濾過手術失敗，據統計青光眼濾過手術2a后失敗率高達20%[2-3]。目前，常用抗代謝藥物抑制青光眼濾過術后手術周圍組織的自我修復，但這些藥物具有一定的毒副作用，因此尋找毒副作用小且高效的治療方法和藥物是目前研究的熱點[4-5]。RNA干擾技術是目前較為先進的技術之一，是利用配對的小片段RNA植入細胞達到阻止同源基因表達的技術[6]�？梢岳肦NA干擾技術抑制成纖維細胞增生相關蛋白的表達，降低患者術后手術失敗率。熱休克蛋白47(heatshockprotein47，HSP47)屬于熱休克蛋白家族，參與組織器官纖維化的生理病理過程[7]。近年來研究發現，相較于正常人群，膠原異常增生性疾病患者的HSP47陽性表達水平異常升高，如病理性瘢痕、梭形細胞脂肪瘤等[8]。而青光眼濾過手術后Tenon囊的愈合與病理性瘢痕有極大的相似之處，因此，推測HSP47與青光眼濾過手術后Tenon囊的愈合有著一定的關聯。本文將探究HSP47siRNA對體外培養人眼Tenon囊成纖維(HTCF)細胞生物學行為及TGF-β1表達水平影響，以期為臨床防控青光眼濾過手術治療失敗提供實驗數據。1材料和方法1.
1材料
1.1.1主要細胞人眼Tenon囊成纖維細胞購自中國科學院細胞庫。
1.1.2主要試劑與儀器Lipofectamine2000(貨號:11668-027，批號:062018)購自美國Invitrogen;Trizol試劑(貨號:15596026，批號:18T1905)購自美國Sigma;AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒購自杭州四季青生物工程材料有限公司;RPMI1640培養基購自美國賽默飛世爾科技公司;Bcl-2抗體(貨號:sc-56015;批號:20190603)、Bax抗體(貨號:sc-70407;批號:20190606)購自美國SantaCruzeBiotechnology;HSP47抗體(貨號:ab242006)、Ki67抗體(貨號:ab205718)、N-cadherin抗體(貨號:ab18203;批號:20190814)、E-cadherin抗體(貨號:ab194982;批號:20191011)購自美國Abcam;Transwell小室購自美國CorningCoseter;光學顯微鏡(型號:BX50)購自日本Olympus;流式細胞儀(型號:AttuneNxT)購自美國賽默飛世爾科技有限公司。
1.2方法
1.2.1細胞培養及傳代取出保存在液氮罐中的HTCF細胞，置于37℃的恒溫水浴中解凍，放入離心機中以1000r/min離心5min，使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基懸浮細胞，置于37℃、5%CO2條件下培養，待細胞融合到約90%時，去除舊的培養液使用PBS沖洗，消化細胞進行傳代培養，取生長狀況良好的細胞進行下列實驗。
1.2.2HSP47siRNA重組質粒的構建根據siRNA的設計原則選擇堿基序列，正義鏈:5'-ACCTCGCCACACTGGGATGAGAAATTTCAAGAGAATTTCTCATCCCAGTGTGGCTT-3'反義鏈:5'-CAAAAAGCCACACTGGGATGAGAAATTTCTCTTGAAATTTCTCACCCAGTGTGGCG-3。通過合成核苷酸序列的稀釋，核苷酸的退火，目的基因與載體的連接，重組質粒的轉化，重組質粒的抽提步驟構建HSP47siRNA重組質粒并通過酶切鑒定和測序鑒定對重組的質粒進行鑒定。
1.2.3重組質粒及分組轉染前將HTCF細胞在CO2細胞培養箱中培養生長匯合至90%～95%，測定質粒DNA濃度達標后，經Lipofectamine2000試劑盒將重組的質粒轉染HTCF細胞，并分為:空白對照組、空載體組和轉染組。轉染組根據HSP47基因序列設計并合成干擾siRNA序列，構建載體并導入HTCF細胞中;空載體組導入空白載體。
1.2.4RT-PCR檢測HSP47mRNA水平取上述培養的HTCF細胞，使用恒溫離心機在4℃的恒溫條件下離心10min，后加入Trizol溶液提取總RNA，經逆轉錄反應合成cDNA鏈，再以cDNA鏈為模板，通過實時熒光定量PCR儀進行擴增。以GAPDH為內參，計算HSP47mRNA的相對水平，實驗重復3次。
1.2.5蛋白質印記實驗檢測蛋白表達取上述培養的HTCF細胞，使用恒溫離心機在4℃的恒溫條件下離心10min，后加入裂解液裂解后提取總蛋白，測定蛋白濃度后混入LoadingBuffer緩沖液，水浴變性10min。電泳分離提取的蛋白樣品，再轉移到PVDF膜，浸于5%脫脂奶粉中室溫下孵育2h，再加入一抗液(1∶1000)中，4℃下孵育過夜。接著加入二抗液(1∶8000)中，37℃孵育1h，最后暗室曝光顯影。計算目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白GAPDH條帶灰度值比值，表示目的蛋白的相對表達量，實驗重復3次。
1.2.6克隆形成實驗檢測細胞增殖取上述培養的HTCF細胞，制備1×105/mL單細胞懸液接種于六孔板，正常培養2wk，顯微鏡下觀察是否有肉眼可見的克隆形成，再滴加結晶紫染液染色并拍照，計算克隆形成率(克隆數/所種細胞數×100%)。
1.2.7流式細胞儀檢測細胞凋亡取上述培養的HTCF細胞，以1000r/min離心5min，充分混勻100μLBindingBuffer、5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，懸浮細胞;室溫避光孵育15min后，再次加入400μL的BindingBuffer混勻后，檢測細胞凋亡情況，細胞凋亡率(%)=(凋亡細胞數/所種細胞數)×100%。
1.2.8Transwell法檢測細胞侵襲以5μgmatrigel均勻包被Transwell小室，調整細胞量2×105個/孔接種于上室，下室添加含有20%胎牛血清的培養基，正常培養24h，去除小室中膜內側表面多余的細胞，固定于多聚甲醛中，結晶紫染色后，隨機選取10個視野，觀察并計數染色細胞(侵襲細胞)數目平均值。實驗重復檢測3次。
1.2.9劃痕實驗檢測細胞遷移取上述培養的HTCF細胞，制備1×105/mL單細胞懸液接種于六孔板，正常培養24h，用1mL槍頭垂直于培養孔中央劃線，100倍顯微鏡下拍照并測量0h“劃痕”寬度，繼續培養24h后再次拍照并測量“劃痕”寬度，細胞愈合率=(0h“劃痕”寬度-24h“劃痕”寬度)/0h“劃痕”寬度×100%，實驗重復檢測3次。
相關期刊推薦：《國際眼科雜志》(月刊)創刊于2000年，是在世界衛生組織和國際眼科理事會的指導和支持下，由中華醫學會西安分會主辦的國際性中英文混合版眼科專業學術期刊。本刊為一綜合性眼科專業學術期刊，涵蓋面廣、信息量大;包括眼科基礎研究和臨床研究及相關學科研究論文。
統計學分析:采用統計學軟件SPSS22.0，多組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗;檢驗水準α=0.05。
2結果
2.1HSP47siRNA對HTCF細胞中HSP47表達的影響由RT-PCR和蛋白質印跡實驗可以看出，相比空白對照組，空載體組HSP47mRNA和蛋白相對表達水平差異均無統計學意義(t=0.484，P=0.645;t=0.753，P=0.480);相比空載體組，轉染組HSP47mRNA和蛋白相對表達水平均顯著降低(t=6.133，P<0.001;t=5.017，P<0.001)，見圖1和表1。
2.2沉默HSP47對HTCF細胞增殖影響由克隆形成實驗和蛋白質印跡實驗可以看出，相比空白對照組，空載體組克隆形成率和Ki67蛋白相對表達水平差異均無統計學著降低(t=9.072，P<0.001;t=11.938，P<0.001)，見圖2，表2。
2.3沉默HSP47對HTCF細胞凋亡影響由流式細胞儀檢測細胞凋亡和蛋白質印跡實驗可以看出，各組細胞凋亡率、Bcl-2和Bax蛋白相對表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖3，表3。
2.4沉默HSP47對HTCF細胞侵襲及遷移影響由劃痕實驗和Transwell小室實驗可以看出，相比空白對照組，空載體組細胞愈合率(t=0.375，P=0.721)、E-cadherin(t=0.470，P=0.655)和N-cadherin蛋白相對表達水平(t=0.773，P=0.469)、單位面積侵襲細胞數目(t=0.561，P=0.595)差異均無統計學意義;相比空載體組，轉染組細胞愈合率(t=3.197，P=0.019)、N-cadherin蛋白相對表達水平(t=3.382，P=0.015)、單位面積侵襲細胞數目(t=4.854，P=0.003)均顯著降低，E-cadherin蛋白相對表達水平顯著升高(t=5.639，P=0.001)，見圖4，表4。
2.5沉默HSP47對HTCF細胞TGF-β1表達水平影響三組TGF-β1蛋白相對表達水平比較，差異有統計學意義(F=13.982，P=0.006)。相比空白對照組(0.78±0.15)，空載體組TGF-β1蛋白(0.81±0.10)相對表達水平差異均無統計學意義(t=0.323，P=0.758);相比空載體組，轉染組TGF-β1蛋白(0.37±0.09)相對表達水平顯著降低(t=4.732，P=0.003)，見圖5。
3討論
青光眼濾過手術失敗的機制較為復雜，其中HTCF細胞的過度增殖是重要因素之一[9]。Ki67是一種常見的調控細胞增殖的蛋白，可維持DNA結構的穩定，并促進細胞有絲分裂，其表達水平越高細胞增殖能力越強[10-11]。本研究通過克隆形成實驗發現，HSP47siRNA可以抑制HTCF細胞的增殖。為了探究其機制，本研究進一步采用蛋白質印跡實驗檢測了Ki67的水平發現，相比空載體組，轉染組克隆形成率和Ki67蛋白相對表達水平均顯著降低。說明HSP47siRNA可以通過抑制增殖相關蛋白的表達實現抑制HTCF細胞的增殖。
HTCF屬于結膜下結締組織，在受到手術創傷刺激下成纖維細胞就會發生轉分化而形成肌成纖維細胞，激活了整個瘢痕反應[12]。其中細胞的凋亡就會促進整個反應，細胞的凋亡受到相關基因的調控，如Bcl-2家族蛋白，該家族中主要包括:Bcl-2蛋白和Bax蛋白，其中Bcl-2是一種抗凋亡基因，Bax是一種凋亡基因，Bcl-2/Bax平衡的變化是促進或抑制細胞凋亡的重要信號[13-14]。本研究發現，HSP47siRNA對細胞的凋亡及相關蛋白表達水平并沒有影響。說明沉默HSP47確實對HTCF細胞的凋亡無影響。
細胞外基質中瘢痕組織的過多聚集也是導致青光眼濾過手術失敗的重要因素之一[15]。HTCF細胞的運動能力增強可以促進細胞外基質中瘢痕組織的聚集，故抑制HTCF細胞的運動能力可以一定程度上防止細胞外基質中瘢痕組織的聚集。上皮間質轉化(epithelialmesenchymltransition，EMT)是調節細胞運動能力的重要機制[16]，上皮細胞暫時極性的喪失將導致細胞獲得間質細胞移動能力[17-18]。同時，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)對于細胞連接、維持細胞正常結構有重要作用，E-cadherin表達下調，將增強細胞的侵襲能力[19-20]。本研究中，轉染組細胞的侵襲和遷移能力受到了顯著的抑制。隨后采用蛋白質印跡實驗發現，轉染組細胞中N-cadherin表達降低，E-cadherin表達升高。說明HSP47siRNA可以通過調控HTCF細胞的EMT過程實現抑制其運動能力，故沉默HSP47表達可減少細胞外基質中瘢痕組織的過多聚集。
TGF-β1是一種多肽類生長因子，是目前為止研究最為廣泛的纖維化因子[21]。TGF-β1可以促進成纖維細胞的增殖，同時還能誘使成纖維細胞的分化，促進前膠原的合成。青光眼濾過手術后，若手術周圍瘢痕組織的過多聚集，將引起手術區域瘢痕性愈合，最終導致手術失敗[22-23]。本研究檢測了HTCF細胞中的TGF-β1含量水平發現，相比空載體組，轉染組TGF-β1蛋白相對表達水平顯著降低。說明沉默HSP47可以有效抑制TGF-β1蛋白的表達，防止手術后區域瘢痕性愈合導致手術失敗。這可能是因為HSP47siRNA抑制了TGF-β1促進膠原合成的作用，緩解了細胞外基質中瘢痕組織的聚集。Zhu等[24]研究表明:通過RNA干擾技術可以有效抑制TGF-β1的合成，抑制HTCF細胞的增殖和成纖維細胞的形成，本研究得出的結論與其相一致。
綜上所述，HSP47siRNA可以抑制TGF-β1促進HTCF細胞的增殖、侵襲及遷移能力，但對HTCF細胞的凋亡無明顯影響。——論文作者：姚莎莎，盤如剛，甘春芳
SCISSCIAHCI
