發布時間：2020-01-15所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:目的利用日落黃與牛乳中蛋白質的吸附特性，探索牛乳中蛋白質的快速檢測方法。方法利用比色法，探討了離心條件、檢測試劑體積、檢測試劑濃度、反應時間、檢測試劑酸度以及三聚氰胺、尿素等非蛋白氮對檢測結果的影響，在優化好的條件下進行了實際樣品的測
摘要:目的利用日落黃與牛乳中蛋白質的吸附特性，探索牛乳中蛋白質的快速檢測方法。方法利用比色法，探討了離心條件、檢測試劑體積、檢測試劑濃度、反應時間、檢測試劑酸度以及三聚氰胺、尿素等非蛋白氮對檢測結果的影響，在優化好的條件下進行了實際樣品的測定。結果1ml牛乳樣品，10ml檢測試劑，0.05%日落黃，反應時間1min，13000r/min離心20min可獲得較好的檢測結果，方法的相對偏差為0.86%。在1.0%～5.0%范圍內，方法的標準曲線方程為y=580x2-53.271x-0.2191。建立的方法用于牛乳樣品中蛋白質的測定，結果與國標一致。結論本文建立的方法可用于牛乳中蛋白質的快速測定和非蛋白氮的快速篩查，有較好的應用前景。
關鍵詞:牛乳;蛋白質;快速;試劑盒
近年來隨著我國乳制品市場的快速發展，牛乳的質量安全越來越引起消費者的廣泛關注。蛋白質的含量是衡量牛乳營養價值高低的重要指標之一。GB5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》是測定食品中蛋白質含量的國家標準方法〔1〕，其中第一法凱氏定氮法和第二法分光光度法測定前均需將樣品中的蛋白質在催化加熱條件下分解，通過測定處理后生成的氨、間接獲得蛋白質的含量。以上方法存在的不足是不能有效區分蛋白氮和非蛋白氮〔2〕，因此不能檢測出三聚氰胺等非蛋白氮的非法添加。同時由于樣品前處理過程復雜，耗時較長，國標方法尚不適于牛乳樣品中蛋白質含量的快速測定〔3-5〕。本研究利用日落黃與牛乳中蛋白質的吸附特性，在樣品不需要加熱分解處理的情況下，通過結合前后溶液顏色的變化實現牛乳中蛋白質含量的快速檢測。相關研究對于實現牛乳中非蛋白氮的快速篩查和牛乳質量監測都具有重要意義。
1材料與方法
1.1主要儀器紫外可見分光光度計，臺式高速離心機TGL-16C，數顯型圓周振蕩器，紅外消化儀，凱氏定氮儀，磁力加熱攪拌器。
1.2主要試劑蛋白質標準溶液購于國家標物中心，日落黃購于上海源葉生物科技有限公司，生鮮乳取自天津市某奶牛養殖廠，市售牛奶購于天津市某超市，超純水由Millipore公司純水機制得。
1.3方法原理酸性條件下日落黃溶液與牛奶中蛋白質絡合并變性沉淀，溶液中日落黃濃度下降，利用絡合前后日落黃溶液濃度變化確定牛奶樣品中蛋白質的含量。
1.4檢測試劑的配制0.1%檢測試劑儲備溶液配制:準確稱取0.2874g日落黃，純水定容至250ml，搖勻。使用時用0.5mol/L的H2SO4稀釋至所需濃度。
1.5標準曲線分別取1ml濃度為0、1%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、5%的蛋白質標準溶液與10ml濃度為0.05%的日落黃溶液混合，13000r/min離心20min后取上清液，稀釋10倍后以1ml純水樣品作對照，于483nm處測定吸光度繪制標準曲線。
1.6樣品測定取牛乳1ml加10ml濃度為0.05%檢測試劑，13000r/min離心20min后取上清液，稀釋10倍后以1ml純水樣品作對照，于483nm處測定吸光度，通過標準曲線計算牛乳中蛋白質的含量。
2結果與討論
2.1離心時間和離心機轉速的影響檢測試劑與牛乳樣品混合后，一方面日落黃與牛乳蛋白絡合，另一方面絡合后的蛋白在酸性條件下變性，因此在一定的轉速條件下需確定合適的離心條件使蛋白完全沉淀。在13000r/min條件下，將10ml濃度為0.001%檢測試劑與1ml牛乳渦旋混合1min后，取上清液于483nm處以純水為參比測定吸光度。結果表明:對于10ml的檢測試劑，13000r/min條件下離心20min后上清液吸光度基本穩定。
2.2檢測試劑濃度的影響檢測試劑中日落黃的濃度對于牛乳中蛋白的吸附效果有關鍵性的作用，在離心時間20min、離心轉速13000r/min、檢測試劑體積10ml的優化條件下，選取濃度分別為0.0005%、0.001%、0.0025%、0.005%、0.01%、0.02%、0.04%、0.05%和0.1%的日落黃10ml，分別與1ml的牛乳混合渦旋1min離心后，取上清液稀釋10倍，于483nm測定吸光度;對照樣品為1ml純水，試驗方法同上。以相同濃度檢測試劑對照樣品與牛奶樣品檢測吸光度的差值為縱坐標，以日落黃濃度為橫坐標，結果如圖1所示。實驗過程中發現濃度為0.0005%～0.01%的檢測試劑在離心后上層均有懸浮物，可能是由于檢測試劑的濃度過低時不能完全將牛乳中的蛋白完全吸附。從圖1可以看出，隨著檢測試劑中日落黃濃度的增大，與牛乳反應前后體系吸光度的差值也不斷增大，0.05%的檢測試劑與樣品混合后的反應前后吸光度差值達到最大，顯色劑濃度繼續增加時差值反而下降，因此實驗下一步選擇檢測試劑中日落黃的濃度為0.05%。
2.3絡合時間的影響檢測試劑中的日落黃與牛奶樣品的蛋白吸附需要一定的反應時間，在上述優化好的實驗條件下，分別選擇1、2、3、5、8、10min的反應時間，其余操作同上，測得結果如圖2所示。由圖中可以看出，日落黃與牛奶中蛋白的絡合時間很短，反應1min以后吸光度基本趨于穩定，考慮到快速檢測應盡量在較短的時間內完成，因此將混合時間確定為1min。
2.4酸度的影響檢測試劑的酸度直接關系到牛乳中蛋白是否完全變性沉淀，只有保證牛乳中的蛋白被完全沉淀，測得的結果才會準確。實驗選取0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.5和1.0mol/L的硫酸作為日落黃的稀釋溶液，按照1.6方法進行測定。以檢測試劑酸度作為橫坐標，吸光度與對照樣品吸光度的差值作為縱坐標，結果如圖3所示。在實驗中可以觀察到0.05～0.4mol/L酸度的檢測試劑在離心后上層均出現不同程度的懸浮物，由于酸度較低使得蛋白凝固的顆粒較小，在離心過程中未能離心下去，而1.0mol/L酸度的檢測試劑的靈敏度與0.5mol/L相比差別不大，故實驗選擇酸度為0.5mol/L的檢測試劑。
2.5溫度的影響考慮到現場快速檢測有可能涉及室外不同的溫度，實驗選取20、25、30、35、40℃等幾個溫度，考察了反應溫度對檢測體系的影響，結果如圖4所示。分析結果可知，溫度對檢測體系的影響很小，40℃時吸光度略有增大，但考慮到實際情況，一般氣溫不會達到40℃，故認為溫度對該實驗的影響基本可以忽略不計。
3方法性能
3.1干擾情況在優化好的試驗條件下，試驗選擇幾種非蛋白氮，以驗證方法的抗干擾性能和在實際應用中鑒別非法添加的能力。實驗分別考察了1.0g/L的尿素、三聚氰胺、甘氨酸對檢測結果的影響，結果表明，在1.0g/L的濃度條件下三種干擾物對檢測體系顯色無干擾，說明非蛋白氮不會影響本方法的檢測結果。
3.2方法精密度取1ml牛乳樣品與0.05%、10ml顯色劑混合1min、13000r/min離心20min后取上清液稀釋10倍后，于483nm處以空白管為參比，測定吸光度，方法的相對偏差為0.86%。
3.3標準曲線在優化的最佳條件下，分別取1ml濃度為1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、5.0%的蛋白質標準溶液，按照1.6方法測定，標準曲線方程為y=580x2-53.271x-0.2191，R2=0.9977，標準曲線如圖5所示。
3.4樣品測定分別選取了1種生鮮乳樣品和2種市售牛乳樣品，采用本法與GB5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》的第一法凱氏定氮法進行測定，結果如表1所示。由表1可知，本法與國標方法的測定結果基本一致，表明本方法適用于牛乳中蛋白質的測定。
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4結論
本研究利用日落黃與牛乳中蛋白質的吸附特性，通過結合前后溶液顏色的變化實現牛乳中蛋白質含量的快速檢測。實驗對離心條件、檢測試劑體積、檢測試劑濃度、混合時間、檢測試劑酸度等條件進行了優化，結果表明在離心20min、離心速度13000r/min、檢測試劑10ml、檢測試劑濃度0.05mol/ml、混合1min、試劑酸度為0.5mol/ml時，獲得了較好的檢測結果。方法與國標方法檢測結果基本一致，可用于牛乳樣品中蛋白質和非蛋白氮的快速檢測篩查。
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