發布時間：2019-11-09所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 背景：人多能干細胞源神經細胞移植治療帕金森病的研究已經取得極大進展，進入了亞臨床研究階段，但依然有許多問題亟待解決，其中一個問題是分化的異質性，這種異質性可以引起移植后宿主體內腫瘤形成、異動癥的發生，給患者帶來了潛在的、不可預估的安全風險
背景：人多能干細胞源神經細胞移植治療帕金森病的研究已經取得極大進展，進入了亞臨床研究階段，但依然有許多問題亟待解決，其中一個問題是分化的異質性，這種異質性可以引起移植后宿主體內腫瘤形成、異動癥的發生，給患者帶來了潛在的、不可預估的安全風險。
目的：總結人多能干細胞分化為多巴胺能神經元的現狀、分化方案設計的原理、誘導流程和異質性分化的研究現狀，為其移植治療實現臨床轉化奠定理論基礎。
方法：英文檢索詞為“iPSC AND Parkinson’s Disease，Induced pluripotent stem cells AND Parkinson’s Disease，ES cells AND Parkinson’s Disease，Embryonic stem cells AND Parkinson’s Disease，Pluripotent stem cells AND Parkinson’s Disease”，中文檢索詞為“多能干細胞 AND 帕金森病，誘導多能干細胞 AND 帕金森病，胚胎干細胞 AND 帕金森病”，由第一作者檢索 1980 至 2018 年 PubMed 數據庫、中文中國知網數據庫和萬方數據庫，查閱近年誘導性多能干細胞源神經元移植治療帕金森病的相關文獻，最終保留 46 篇文獻進行總結。
結果與結論：多能干細胞應用各種不同體外誘導分化方案，可誘導分化為 A9 多巴胺能神經元，移植后可以促進帕金森病模型動物的行為學及肢體功能的恢復。然而目前的分化方案產物中除了可以分化為 A9 多巴胺能神經元外，還包括 A10 多巴胺能神經元、5-羥色胺能神經元等不同的神經元，尚無一種分化方案可以達到均一性分化。優化多能干細胞體外誘導分化條件，同質性分化為 A9 多巴胺能神經元可以進一步改善帕金森病模型動物的行為學表現，促進該細胞療法的臨床轉化。
關鍵詞：帕金森病;誘導性多能干細胞;多巴胺能神經元;細胞分化;細胞移植;異質性;干細胞;國家自然科學基金
0 引言 Introduction
帕金森病是最常見的中樞神經系統退行性疾病，主要發病機制為紋狀體區多巴胺遞質降低，臨床癥狀包括靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢平衡障礙等運動癥狀[1]，以及嗅覺減退、快動眼期睡眠行為異常、便秘和抑郁等非運動癥狀[2]。最明顯的病理特征為黑質致密部A9多巴胺神經元選擇性變性和細胞內Lewy小體聚集，但A9多巴胺神經元選擇性變性的原因尚不清楚[3]。隨著人口老齡化和壽命的延長，帕金森病的發病率不斷增加，中國65歲以上人群患病率約1.7%，約260多萬帕金森病患者，幾乎占了全世界患者的一半，給家庭和社會帶來沉重的負擔[4]。
帕金森病的藥物治療已經有50多年的歷史，藥物以左旋多巴或多巴胺能受體激動劑的形式作用于功能失調的多巴胺能神經網絡來減輕運動障礙。這些治療在疾病早期非常有效，但最終會產生嚴重的不良反應，如運動并發癥(癥狀波動、異動癥)，幻覺和一系列中樞多巴胺受體的非生理刺激相關的行為和精神癥狀[5]。在疾病后期藥物無法控制運動并發癥的情況下，腦深部電刺激、皮下注射阿撲嗎啡、卡比多巴-左旋多巴腸凝膠連續輸注等輔助療法可以作為備選治療手段[6]。這些輔助療法對控制運動并發癥有一定療效，但其局限性也不容忽視，如對非運動癥狀作用有限，相關不良事件、感染、腦血腫以及心理和行為異常等發生率較高[7-8]。綜上所述，藥物治療和設備輔助治療僅僅可以減輕疾病癥狀，不能治愈或減緩疾病進程。
鑒于其流行病學重要性，帕金森病可被視為一個公共衛生問題，其表現包括社會、家庭、經濟、甚至法律問題，并對醫療保健系統造成巨大的經濟影響[9]。因此，需要尋找新的療法以治愈或延緩帕金森病的進展。最理想的療法是替代已經失神經支配的多巴胺能神經元，重建生理性多巴胺輸送系統。
胚胎腹側中腦組織中含有多巴胺能神經祖細胞，由于諸多問題，移植該組織細胞進行細胞替代治療帕金森病難以大規模開展。人多能干細胞因其擁有自我更新和分化成多種人類細胞類型的潛能，為帕金森病細胞治療提供了可能，文章綜述了細胞替代療法發展與現狀，介紹了中腦多巴胺能神經元發育的前后模式和背腹模式。人多能干細胞體外誘導分化方案模擬人胎腦正常中腦發育模式來設計，經過神經干細胞、中腦多巴胺能祖細胞、終末細胞成熟，其可分化為A9多巴胺能神經元，重建生理性多巴胺輸送系統，移植后可以促進帕金森病模型動物的肢體功能恢復[10]。
在體內，細胞分化受到局部分泌的形態發生素和生長因子的調節，且分化過程需要各種形態發生素在時間和空間上精密調控，其可誘導細胞內途徑的激活，通過激活特定的轉錄因子，促進相關基因表達進而導致細胞分化。由于目前尚未完全掌握相關分化的機制，在體外分化產生是多巴胺能神經元和其他非典型的細胞類型如丘腦底核的5-羥色胺神經元的混合物。多巴胺能神經元包括3個亞型：A8，A9和A10亞群，但宿主腦內只有產生A9多巴胺能神經元才能整合到去神經支配的紋狀體，促進肢體運動功能恢復。這種異質性可以引起移植后宿主體內腫瘤形成、異動癥的發生，給患者帶來了潛在的、不可預估的安全風險。目前研究熱點集中在如何優化多巴胺能神經祖細胞，對終末分化的異質性現象尚未引起足夠重視。文章分析總結了異質性分化帶來的后果及產生該現象可能機制，歸納了相關實驗研究進展，提出了解決該問題的可能改善策略，為將來同質性分化以及移植效果的優化提供了參考。
1 資料和方法 Data and methods
1.1 資料來源 英文檢索詞“iPSC AND Parkinson’s Disease ， Induced pluripotent stem cells AND Parkinson’s Disease ， ES cells AND Parkinson’s Disease ， Embryonic stem cells AND Parkinson’s Disease ， Pluripotent stem cells AND Parkinson’s Disease;中文檢索詞“多能干細胞 AND 帕金森病，誘導多能干細胞 AND 帕金森病，胚胎干細胞 AND 帕金森病”，由第一作者在2018年3月進行檢索，檢索1980 至2018年PubMed 數據庫、中國知網數據庫和萬方數據庫，查閱近年誘導性多能干細胞源神經元移植治療帕金森病的相關文獻，最終保留46篇文獻。
1.2 入選標準 ①內容相關程度高;②具有原創性，且觀點明確，論據可靠的文獻;③內容相近的選擇近期或在權威雜志發表的文獻。
1.3 質量評估 共收集到581篇相關文獻。閱讀標題和摘要進行初篩，最后保留46篇相關度高，且符合核心內容的文章進行綜述。文獻篩選流程見圖1。
2 結果 Results
2.1 帕金森病的細胞替代療法現狀 胚胎腹側中腦組織中含有多巴胺能神經祖細胞，其移植治療帕金森病患者的臨床研究已經開展了30多年。盡管臨床結局好壞不一，但這些臨床研究已證明細胞替代療法的確是一種非常有希望的治療策略，成為持續的研究熱點[10]。然而由于倫理問題，難以得到大量的胎兒中腦組織，存在移植物質量參差不齊，難以標準化等問題，胚胎腹側中腦細胞移植很難大規模開展。
人多能干細胞(human pluripotent stem cells， hPSCs)包括人胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)和人誘導多能干細胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)，均具有自我更新和分化成多種人類細胞類型(包括中腦多巴胺能神經元)的潛能[11]。因此，人多能干細胞為細胞替代療法的開展提供了有價值的資源[12-13]。通常情況下，人多能干細胞在體內分化的不可控性，并不適合直接移植。此外，神經干細胞傾向于分化為中間神經元類型和星形膠質細胞，體外很難產生足夠數量的多巴胺能神經元，因此從治療的安全性和有效性綜合考慮，移植已經定向的多巴胺能祖細胞更具可行性[14]。Kikuchi小組[15]的實驗顯示無飼養層和無血清條件下由人誘導多能干細胞分化衍生的多巴胺能神經元，在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine， MPTP)損傷的帕金森病猴體內存活6個月。該報道支持人誘導多能干細胞對未來臨床試驗的治療潛力。Kirkeby 小組[16]則使用優化的方案分化人胚胎干細胞，將衍生的多巴胺能神經元移植入紋狀體內，能改善6-羥基多巴胺誘導的半帕金森病大鼠運動功能。同時多個研究小組證實，通過特定的誘導方案可將人多能干細胞分化為A9 多巴胺能神經元[17-19]。移植后的多巴胺能神經元可以在動物模型腦內存活、神經支配，促進功能修復[20-21]，而沒有產生腫瘤[22]。2017年中國科學院周琪院士主持的 “人胚胎干細胞來源的神經祖細胞治療帕金森病”的臨床前期研究在鄭州大學第一附屬醫院正式開展，表明干細胞替代療法已經十分接近臨床。
2.2 當前人多能干細胞分化為中腦多巴胺能神經元誘導方案的設計基本原理及機制
2.2.1 中腦多巴胺能神經元發育的前后模式和背腹模式 在胚胎發育過程中，發育模式和細胞命運特異性分化受到局部分泌的形態發生素和生長因子的調節。神經的形成是一個發展的過程。它從外胚層開始，神經上皮層或神經板折疊形成神經管，大腦和脊髓從該神經管發育而來。神經管沿著延喙尾軸和背腹軸生長，此發育模式在時間和空間上受沿前后模式和背腹模式軸分布的形態發生素濃度梯度的協調控制。此過程中，細胞分化由形態發生因子和鄰近細胞分泌的信號分子誘導[23]。影響前后模式的形態發生素包括成纖維細胞生長因子、 WNT和視黃酸，經典WNT/ β-catenin信號通路在其中扮演了關鍵角色。影響背腹模式的成分包括WNT、骨形態發生蛋白和音猬因子，SHH信號通路起到了決定性作用。沿前后模式和背腹模式軸分布的形態發生素濃度梯度限定了轉錄密碼和特定區域神經前體細胞的身份，見圖2。形態發生素濃度輕微的變化就可以引起細胞命運的轉變[24]。這兩種模式是體外方案中調控WNT信號通路和SHH信號通路可以決定中腦神經前體表型的理論依據。
2.2.2 分化方案的步驟及設計原理 人多能干細胞分化為中腦多巴胺能神經元誘導方案模擬人胎腦正常中腦發育模式，幾乎所有分化方案都圍繞下述原理和機制來設計。
第一階段為神經誘導，即外胚層細胞向神經干細胞的分化。該分化受到屬于轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)蛋白超家族的骨形態發生蛋白的調控。因此，通過抑制骨形態發生蛋白和TGF-β/ SMAD信號傳導可啟動神經誘導[25]。在分化方案的起始階段，采用“雙SMAD抑制劑”策略保證神經方向分化。 SB431542和NOGGIN分別抑制 Lefty/Activin/TGFβ/ SMAD通路和BMP/SMAD信號通路，使干細胞退出多能干狀態，分化為神經干細胞，以確保外胚層既不分化為表皮組織，又不分化為內、中胚層組織[24]。
第二階段為中腦多巴胺能神經祖細胞的定型和區域化。神經干細胞分化為中腦多巴胺能祖細胞。中腦正常發育定型有兩個信號中心，中腦腹側底板(floor plate， FP)的Shh-Foxa2信號回路和中、后腦交界處峽部組織 (isthmic organizer，IsO)的OTX2-WNT1-Lmx1a/Msx1 信號回路。前者決定了神經祖細胞的腹側身份，后者決定了其后端側身份，這兩個信號回路之間互相作用，產生了微妙的動態平衡，決定了中腦多巴胺能神經祖細胞正確的身份。在此階段，添加音猬因子(SHH)或SHH激動劑可以促進神經祖細胞的腹側化，添加糖原合成酶激酶3β抑制劑CHIR99021使WNT1-Lmx1a/Msx信號通路激活，促進神經祖細胞的后端化。上述這兩種效應均呈劑量依賴性，確保神經干細胞不分化為前腦、后腦和脊髓等其他區域的神經祖細胞[26-27]。
第三階段為中腦多巴胺能神經祖細胞終末分化，確保分化為成熟的中腦多巴胺能神經元。目前的分化方案均添加腦源性神經營養因子、膠質細胞源性神經營養因子等，促進中腦多巴胺能神經元的成熟[28]。中腦多巴胺能神經元分為A8、A9、A10亞群，所有中腦多巴胺能神經元均起源于中腦底板室帶區的神經祖細胞，但祖細胞階段如何決定多巴胺能神經元亞群表型和功能的多樣性，以及相關分子機制仍知之甚少。
2.2.3 目前誘導方案的研究進展 早期分化方案產生大量的TH+ 神經元，但沒有共表達中腦多巴胺能神經元的兩種轉錄因子FOXA2和LMX1A。后續方案在正確指定中腦多巴胺能神經元的基礎上，用SHH和FGF8處理后表達出LMX1A，得到的培養物含有50%TH+ 神經元，其中大部分共表達中腦多巴胺能神經元標記，如 LMX1B、NURR1、PITX3和DAT。還有方案添加GSK3β 抑制劑，其可有效產生人多能干細胞源中腦多巴胺能神經元，培養物中有80%FOXA2+ 細胞和75%TH+ 細胞[29]。最近一項研究由Kirkeby小組[20]提出，分階段的應用 FGF8b可修飾人胚胎干細胞衍生的多巴胺能祖細胞向尾部腹側中腦細胞分化。
2.3 中腦多巴胺能神經元亞型分化的機制研究現狀 中腦多巴胺能神經元包括3個亞型：A8，A9和A10亞群。A8 亞群位于紅核后區(retrorubral field，RrF);A9亞群位于黑質致密部(substantia nigra compacta，SNc);A10亞群位于腹側被蓋區(ventral tegmental area，VTA)。當前對A9、A10亞型多巴胺能神經元的起源及功能研究較多，SNc/A9多巴胺能神經元主要表達Aldh1a1和Girk2/ KCNJ6，而VTA/A10神經元主要表達鈣結合蛋白Calb1， Calb2(calbindin 1和2)和Cck(膽囊收縮素)。這3種亞型的多巴胺能神經元纖維分別投射到不同腦區，產生不同的生理功能[30]。僅有黑質致密部A9多巴胺能神經元變性引起帕金森病。A9和A10神經元共同起源于中腦底板室帶同一位置的放射狀膠質細胞，神經多巴胺能祖細胞早期分化為A9神經元，晚期分化為A10神經元。上述現象提示中腦多巴胺能神經元亞型的決定因素是在神經祖細胞形成之后的發育階段中。
體內動物發育模型中，調控中腦多巴胺能神經元亞群的發育分子機制歸納為以下6個方面：①SOX6 和 OTX2協調作用，調控神經祖細胞，產生不同的亞群;其中SOX6對神經元亞型分化的調控作用已經在大腦皮質中間神經元和胃多巴胺能神經元等神經發育中得到體現。SOX6是第一個調控腸神經系統單一多巴胺能神經元亞型發育的轉錄因子[31-32];②Pitx3和En1協調作用，調控正在有絲分裂的多巴胺能神經元，產生不同的亞群;③Rspo2調節WNT信號通路，減輕黑質A9神經元的易損性;④Ahd2具有解毒功能，抵抗黑質A9神經元變性，保護神經元;⑤Mest通過WNT信號通路影響黑 質 A9 神經元發育;⑥ NeuroD1 和 NeuroD6 調 控 VTA/A10神經元的發生。目前分化方案主要是集中在提高神經多巴胺能祖細胞的表達階段，對如何調控祖細胞分化為多巴胺能神經元亞型的研究較少[33-34]。
2.4 人多能干細胞向中腦多巴胺能神經分化過程中的異質性研究進展 盡管人多能干細胞替代療法治療帕金森病已經邁出了進入臨床階段的第一步，但目前仍然存在諸多需要進一步優化解決的問題，在體內，中腦神經管室帶中的神經干細胞放射遷移至中間帶，在此發育為神經囊胚，繼續遷移至邊緣帶發育為A9多巴胺能神經元，并正切遷移至黑質致密部，該部位細胞類型一致，呈現“均一性”。這個過程需要各種成形素在時間和空間上精密調控才能完成[35]。在體外，尚無分化方案能達到如此“均一性”分化。雖然在過去幾年中，人多能干細胞產生誘導性多巴胺能神經元已取得了實質性進展[36-37]，產生的仍是多巴胺能神經元和其他非典型的細胞類型的混合物[11，38-39]。這種異質性可以引起移植后宿主體內腫瘤形成、異動癥的發生，給患者帶來了潛在的、不可預估的安全風險[40]。目前大多數的分化方案，獲得SNc/A9多巴胺能神經元的效率多在40%-50%之間，最高達到 75%[18]。綜上，如果要解決這些難點，均無法回避一個核心問題，即現有的分化方案并不十分完美，人多能干細胞源多巴胺能神經分化產物中存在“異質性”，有進一步優化的必要性。
目前的研究熱點集中在除中腦多巴胺能神經元以外的其他類型細胞鑒定、產生原因和如何清除等方面。研究顯示，在目前不斷優化的通用方案調控下，分化產物中其他類型細胞主要是丘腦底核的5-羥色胺神經元[11，17，39-40]，主要原因是目前認定的中腦多巴胺能神經祖細胞既可以產生中腦多巴胺能神經元，又可以產生 5-羥色胺神經元。Xia等[11]建立了擁有酪氨酸羥化酶 (TH)-RFP(紅色熒光蛋白)報道基因的人胚胎干細胞系，使用這個TH-RFP報道細胞系能夠從異質培養物中純化中腦多巴胺樣神經元。Nolbrant等[17]提供了一個詳細的 16 d分化方案，以獲得高純度的腹側中腦多巴胺祖細胞，用于在動物模型中的大腦內移植，該方案有助于在不同實驗室和各種人胚胎干細胞系統中實施。Samata 等[39]表示人誘導多能干細胞衍生的供體細胞不可避免有致瘤性或異質細胞。為了消除這些異質細胞，已經開發了使用針對特定標記物如CORIN或ALCAM抗體的細胞分選，但是這兩種標記物對于腹側中腦都不是特異性的。實驗小組對表達CORIN和LMX1A陽性細胞采用雙重選擇策略，并報道細胞表面標記LRTM1以富集中腦多巴胺能祖細胞。當移植到6-羥基多巴胺損傷大鼠體內時，人誘導多能干細胞衍生的LRTM1+ 細胞在體內存活并分化成中腦多巴胺能神經元，運動行為顯著改善且沒有腫瘤形成。Kee等[40]運用單細胞分析揭示分化的多巴胺和丘腦底核神經元譜系之間的密切關系，表示單細胞 RNA-seq可以重建LMX1A+神經元發生發展，同時 LMX1A+ 群包含不同的中腦多巴胺和STN譜系，其中 STN和中腦多巴胺譜系相關但又有截然不同的轉錄因子譜，應用不同的標記可以幫助優化人胚胎干細胞衍生的中腦多巴胺能神經祖細胞的分化。目前正在尋找特異性更強的中腦多巴胺能神經祖細胞抗體標記物或熒光標記的報道基因配合流式細胞儀篩選，以清除分化產物中的5-羥色胺神經元[11，20，40-41]。
然而，分化異質性的另一方面，由中腦多巴胺能神經元不同亞群引起的異質性尚未引起足夠重視。體外培養和體內移植實驗均證實，在同一分化方案、同一移植宿主中，人多能干細胞可以同時分化SNc/A9和VTA/A10 亞型兩種多巴胺能神經元[17-18，41]。
3 討論 Discussion
對帕金森病患者而言，并非所有中腦的多巴胺能神經元都有效。帕金森病動物模型實驗證實，SNc/A9和 VTA/A10多巴胺能神經元纖維保持發育時的投射傾向， A9多巴胺能神經元的神經纖維投射至紋狀體背外側， A10多巴胺能神經元的神經纖維投射至額葉皮質;只有黑質致密部的A9多巴胺能神經元移植才能在宿主體內重新建立廣泛的終端神經網絡，整合去神經支配的紋狀體，促進肢體運動功能恢復[17]。
解決策略一：尋找可以特異性分化為A9多巴胺能神經元的神經祖細胞標記物，之后對神經祖細胞進行流式細胞儀篩選。Sundberg小組[42]采用流式細胞術除去不需要的細胞類型并富集中腦多巴胺能神經元或其亞型。從中腦底板方案分化的人多能干細胞群體中分選 NCAM+ CD29low細胞以去除非神經致瘤細胞并富集 FOXA2+ ，LMX1A+ 和TH+ 神經元，這些細胞的移植促進了帕金森動物模型的行為恢復。Doi小組[21]用CORIN分選，移植表達中腦多巴胺標記FOXA2、LMX1A的誘導細胞，其在6-羥基多巴胺損傷的大鼠體內存活并誘導行為恢復而沒有腫瘤形成。但是，一方面目前尚未找到能產生中腦多巴胺能神經元的特異性神經祖細胞標記物[43]，離臨床實踐仍有較遠的距離。另一方面流式細胞儀的篩選尚有許多需要進一步解決的問題，如標記的方法是否影響細胞后續的培養，細胞是否能夠耐受長時間接觸氧氣和二氧化碳，機器的無菌情況等各個方面，限制了廣泛的臨床使用。
解決策略二：精細地調整分化方案，針對性的提高 A9多巴胺能神經元產量，可以從根本上解決異質性問題。Fasano小組[44]發現在神經誘導期間使用高水平的 SHH對于底板特征是關鍵的;Andersson小組[45]證實 WNT/β-catenin信號傳導是中腦多巴胺能神經元發育中的必需途徑;在實驗中加入GSK3β抑制劑可以有效產生人多能干細胞衍生的中腦多巴胺能神經元，其中含 80%FOXA2+ 細胞和75%TH+ 細胞[43，46]。Doi小組[21]研究使用層粘連蛋白511-E8在中腦底板誘導期間促進人多能干細胞衍生細胞的黏附。最近一項研究中，Kirkeby 小組[20]應用一組預測性標記物，可幫助改進分化方案并改善基于人胚胎干細胞治療帕金森病模型的移植效果，人胚胎干細胞衍生的多巴胺能祖細胞的共同標記物與移植結果相關性小，而尾部的中腦標記物與移植后的多巴胺能神經元在體內的產量具有相關性，同時在誘導人胚胎干細胞向多巴胺能祖細胞分化過程中分階段應用 FGF8b，可修飾人胚胎干細胞衍生多巴胺能祖細胞向尾部腹側中腦細胞分化。以上分化方案設計重點均集中在通過各種手段提高中腦多巴胺能祖細胞的表達[17，24，36]。但是目前對如何定向調控相關細胞因子表達來提高A9 多巴胺能神經元產量及機制仍然知之甚少，亟待更加深入研究。
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