發布時間：2019-11-02所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要 乳腺癌是影響女性健康最主要的惡性腫瘤之一.表觀遺傳修飾及活性氧(ROS)過度積累引起的氧化應激在乳腺癌發生發展中起關鍵作用，表觀遺傳修飾與 ROS 的生成和清除相互影響.本文通過對目前有關表觀遺傳修飾和 ROS 參與乳腺癌的發生發展進行綜述，為尋求乳
摘要 乳腺癌是影響女性健康最主要的惡性腫瘤之一.表觀遺傳修飾及活性氧(ROS)過度積累引起的氧化應激在乳腺癌發生發展中起關鍵作用，表觀遺傳修飾與 ROS 的生成和清除相互影響.本文通過對目前有關表觀遺傳修飾和 ROS 參與乳腺癌的發生發展進行綜述，為尋求乳腺癌發生發展的生物標志物及精準治療提供思路。
關鍵詞 表觀遺傳修飾，活性氧，氧化還原狀態，乳腺癌
Globocan 腫瘤流行病學數據顯示，2012 年全球女性乳腺癌新發病例與死亡數位居女性惡性腫瘤首位，中國近年女性乳腺癌發病例數和死亡例數在世界范圍位居前列，其發病增長速度超全球 2 倍，成為女性發病率最高的癌癥.乳腺癌的異質性和在病因學上相關的基因組演變，使現有治療方案總體效果不盡人意，所以尋找新的作用靶點將對乳腺癌的治療研究具有重要意義.表觀遺傳機制已經成為乳腺癌發生進展的基本參與者，因其變化的可逆性可作為治療乳腺癌的靶標.研究表明乳腺癌組織具有較強的氧化應激狀態和明顯的抗氧化能力[1].表觀遺傳修飾與 ROS 的相互作用影響著乳腺癌的發生發展，研究表觀遺傳修飾與 ROS 的相互作用可能對研究乳腺癌中的靶向治療提供新途徑，為精準治療及個性化治療提供可能的機會.
1 乳腺癌中的表觀遺傳修飾
表觀遺傳是指核苷酸序列不發生變化的情況下，基因的表達活性發生了可遺傳的變化，包括 DNA 甲基化、組蛋白修飾、非編碼 RNA 調控及染色體重塑等，會導致基因轉錄失調和細胞增殖失常，從而致癌.其中以 DNA 甲基化和組蛋白修飾的研究最為重要.表觀遺傳修飾因具有可逆性變化的特點，可以作為治療乳腺癌的靶點 . Teschendorff 等[2]證明在鄰近癌癥的正常組織中存在數以萬計的表觀遺傳學改變，從而支持乳腺癌在表觀遺傳領域存在修飾.癌發生早期階段，DNA 甲基化和組蛋白修飾引起的染色質結構改變影響細胞可塑性，促進乳腺細胞獲得不受控制的自我更新特性;癌發展后期階段，添加的表觀遺傳學改變及微環境的信號會調節癌細胞表型并影響腫瘤的轉移傾向[3].
1.1 DNA 甲基化
DNA 甲基化指 DNA 復制后，S 腺苷甲硫氨酸 (SAM)上的甲基基團在 DNA 甲基轉移酶(Dnmt)催化下連接到 DNA 分子胞嘧啶上形成 5- 胞嘧啶的過程，主要位點是富含 CpG 二核苷酸的 CpG 島. CpG 島常位于轉錄調控區附近，多項研究證實基因組整體低甲基化往往伴隨著局部的 DNA 高甲基化及該區域基因表達沉默.腫瘤發生早、晚期 Dnmt 表達增加，表明 DNA 異常甲基化誘導了腫瘤的發生和發展.Leu 等[4]利用 RNA 干擾技術發現，在癌細胞中所有 Dnmt 都協同性地過度表達(尤其是 Dnmt1 和 Dnmt3b)以維持 DNA 甲基化和基因沉默.原癌基因 KIT 受體酪氨酸激酶在調節細胞增殖、存活和遷移過程中發揮重要作用. Radoslav 等[5]的研究表明，與正常乳腺組織相比， KIT 啟動子在乳腺腫瘤中高甲基化.Good 等[6]通過乳腺癌的生物信息學分析，發現 TET1 的低甲基化會激活致癌途徑，這種低甲基化與激活 PI3K 突變相互排斥，表明去甲基化可能是激活該致癌途徑的替代機制.在乳腺癌中，已有 100 多個基因的啟動子發生甲基化，且這些基因在 DNA 修 復 ( 如 BRCA1)、組織侵入轉移和調節細胞轉錄中發揮重要作用.研究乳腺癌的甲基化差異，可能針對個體的不同甲基化修飾提出個性化治療方案，這符合精準醫學的要求.
1.2 組蛋白修飾
組蛋白是核蛋白染色質中與 DNA 分子密切相關的結構，在基因表達調控中發揮重要作用，共有 5 種類型：H1、H2A、H2B、H3 和 H4.其中 H1 作為連接蛋白參與染色質的高級結構，其他 4 種與 DNA 結合形成核小體.翻譯后修飾是表觀遺傳調控的一個主要組成部分，根據細胞核內的信號環境，破壞 DNA 與組蛋白的相互作用改變核小體結構，或形成轉錄調節因子的結合位點來影響染色質結構，最終影響病理細胞反應.腫瘤細胞的主要特征之一是組蛋白高甲基化和低乙�；�.2014 年李海濤教授課題組[7]的研究首次揭示出生物體內存在組蛋白變體特異的甲基化識別蛋白.這種對組蛋白變體和甲基化修飾類型的雙重識別，體現了真核生物表觀遺傳調控的復雜性和重要性，相關結構研究成果也為基于腫瘤抑制因子 ZMYND11 靶向的小分子抑制劑篩選提供了重要理論基礎.
1.2.1 組蛋白甲基化
大部分組蛋白甲基化酶(KMT)含 SET 結構域，使組蛋白發生 2 倍或 3 倍甲基化，導致染色體空間結構松散，影響下游轉錄因子與靶基因的結合，最終促進腫瘤細胞生長、侵襲和遷移.組蛋白去甲基化酶(KDM)分兩類：一類為賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶 1(LSD1)，對調控上皮 - 間質細胞轉換 (EMT)的基因起重要作用;另一類是含 JmjC 結構域的蛋白質家族，可對組蛋白多個位點進行去甲基化，調控轉錄、細胞增殖和腫瘤發生等多種生物學過程.
組蛋白甲基化引起的基因表達、激活或抑制取決于被修飾的氨基酸殘基.如 組 蛋 白 H3 上 賴氨 酸 4 的單甲基化或三甲基化 (H3K4me1 或 H3K4me3)和賴氨酸 36 上的三甲基化(H3K36me3) 與開放染色質激活轉錄有關，而組蛋白 H3 上的賴氨酸 9 和 27 的三甲基化(H3K9me3 和 H3K27me3) 與致密染色質抑制基因表達有關[3].LSD1 在雌激素受體陰性乳腺癌中高表達，與癌細胞的侵襲性有關，LSD1 減少會導致體外生長抑制[8].Messier 等 [9] 使 用 全 基 因 組 ChIP-Seq 方 法 評 估 正 常 (MCF-10A)、 致 瘤 性 (MCF-7)、 促 轉 移 性 (MDA-MB-231) 3 種乳腺癌細胞系，發現啟動子處 H3K4me3 的增加主要發生在三陰性 MDA-MB-231 細胞系中，表明組蛋白甲基化可能與增加乳腺癌的轉移潛能相關.Al Emran A 等[10]使用乳腺癌細胞系生成誘導藥物耐受細胞(IDTC)，在 IDTC 中觀察到 H3K4me3 和 H3K27me3 的缺失和 H3K9me3 標記增加，這是對藥物暴露或營養饑餓的明顯反應，而且這些表觀遺傳變化在停止用藥后可逆.
1.2.2 組蛋白乙�；�
乙酰化由組蛋白乙酰基轉移酶(HAT)和去乙�；�(HDAC)共同調控，是一種可逆的蛋白質共價修飾形式.組蛋白的乙�；梢詼p少賴氨酸殘基與 DNA 的相互作用，使組蛋白與 DNA 分離，利于打開染色質使其成為開放結構，促進轉錄因子與 DNA 結合，啟動基因的轉錄和表達.研究證實， HAT 有抑制腫瘤的功能，但 HAT 的過量表達同樣可以導致癌癥的發生[3]，當 HDAC 過量或 HAT 的數量減少時，組蛋白乙酰化的平衡將偏向去乙�；�，從而導致基因表達的調節異常，因此，HAT 和 HDAC 之間的失衡引起的表觀遺傳變化會嚴重影響基因的轉錄且與腫瘤的發生和進展相關.由此可見，腫瘤細胞內過表達的 HDAC 可以作為精準治療的靶蛋白.
組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACi)可競爭性抑制底物蛋白質與 HDAC 結合，促進組蛋白乙�；揎棧谵D錄.Muller 等[11]未發現 HDAC1 或 HDAC2 與乳腺癌的預后有任何關聯，而 Schech 等[12] 證明 HDACi 能有效地選擇性抑制Ⅰ類 和Ⅳ類 HDAC，且能夠逆轉乳腺癌細胞系中的 EMT. Messier 等[9]證明組蛋白 H3 的賴氨酸 4 的乙�；� (H3K4ac)標記增加是乳腺癌惡性轉化所必需的，組蛋白 H3 的賴氨酸 9 的乙�；�(H3K9Ac)與開放染色質區域相關.Cui Z 等[13]的研究表明，乳腺腫瘤中更常見到 HDAC3 的高表達、HDAC3 高表達與乳腺腫瘤的 ER 陰性表達、PR 陰性表達、HER2 過表達、PT 分期和臨床分期密切相關，并得出 HDAC3 可能是浸潤性導管乳腺癌的一個合適的預后指標.總體而言，這些數據表明特定組蛋白修飾在改變乳腺癌表觀基因組中起關鍵作用，并導致乳腺腫瘤的異質性.因此，我們可以通過靶向特定組蛋白修飾位點為乳腺癌提供治療方案.
2 氧化還原狀態與乳腺癌
ROS 又稱“氧自由基”，主要產生于線粒體，是需氧生物體內氧分子經呼吸鏈中的單電子逐步還原形成的一類物質，具有很強的氧化性，包括過氧化 氫(H2O2)、超氧 陰 離 子(O2 ·)、羥自 由 基(·OH) 等.胞內的 ROS 大部分來自于線粒體的氧化磷酸化過程，還有部分來自胞漿，如 NADPH 氧化酶和 PKCβ/p66Shc 通路，它們可直接感受外源刺激，誘導胞內產生 ROS.同時機體自身也有一套完整的抗氧化防御系統，使細胞內 ROS 的產生和降解處于平衡狀態，保護細胞膜和組織免受損害.抗氧化系統包括兩部分：第一部分為抗氧化酶類，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等;第二類是含巰基的小分子蛋白質，包括硫氧還蛋白(Trx)和還原性谷胱甘肽(GSH)等.當機體遭受有害刺激使細胞內 ROS 不能被及時有效清除而過度積累時，氧化系統失衡，出現“氧化應激態”，引起機體多種分子(線粒體、DNA、蛋白質等)的氧化損傷.
乳腺癌的轉移能力與細胞氧化還原狀態密切相關.氧化還原失衡可以通過氧化還原依賴性的活化蛋白激酶 C(PKC)促進生長因子和整合素信號傳導，導致絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號級聯和腫瘤細胞遷移[14].ROS 在癌癥中有雙重用途，它不僅可以激活細胞凋亡途徑殺死癌癥細胞，還可保護正常組織免受放射、化療毒性.ROS 存在這種潛力是因為惡性細胞的增殖和自我更新依賴細胞內 ROS 的升高，且基于正常健康細胞不具有升高 ROS 水平的可能[15].氧化還原狀態與腫瘤發生發展的相互關系如圖 1 所示.
2.1 H2O2 水平與乳腺癌
H2O2 是 O2 的雙電子還原產物，目前至少已有 30 種酶被鑒定為 H2O2 產生酶[16]，包括超氧化物歧化酶(SOD)、NOX 和黃素蛋白脫氫酶.H2O2 可作為信使攜帶一個產生的氧化還原信號到達目標部位，調節轉錄因子 AP-1、Nrf2、CREB、HIF-1α、 p53、NF-κB、SP1 的活性和 EMT[17].H2O2 濃度依賴于 AP，同時對維持穩態有關鍵作用.H2O2 水平可能對細胞生長有正面或負面的影響，這取決于 H2O2 增加的水平及所在細胞位置.已經表明，O2 · 與 H2O2 的比例決定了癌癥的走向：O2 ·過多支持細胞存活并促進腫瘤發生，而 H2O2 過多則誘導細胞死亡信號傳導[18].乳腺癌細胞在 DNA 損傷程度很高時，在低濃度 H2O2 刺激下進行細胞分裂，而較高濃度會抑制細胞生長并最終導致細胞死亡[15].
2.2 錳超氧化物歧化酶 (MnSOD) 與乳腺癌
SOD 是錳依賴性酶，可抑制信號傳導 . MnSOD 是控制線粒體中 ROS 量的關鍵因素，至少有 2 個主要功能：一個是抗氧化功能，防止過量 O2 導致 O2 ·積累的防御機制;另一個功能是能將 O2 ·轉化為 H2O2.相比于正常細胞，侵略性癌癥中的 MnSOD 和氧化應激增加.MnSOD 具有腫瘤抑制和促進功能，在癌癥中的雙重作用主要與其在癌癥的某個階段是作為線粒體 ROS 清除劑還是 H2O2 生成劑有關[19].如果 MnSOD 是 H2O2 生成劑，則 MnSOD 的過表達會抑制癌癥生長，但如果 MnSOD 是一種線粒體超氧化物清除劑，MnSOD 的抑制將增強癌細胞死亡.研究結果支持 MnSOD 在抵抗 ROS 介導的損傷，保護人正常組織中的作用[15].人乳腺上皮細胞 MCF-10A 中的 MnSOD 活性在增殖階段比靜止狀態明顯下降[20]，乳腺癌細胞中表現出顯著的 MnSOD 上調，其通過影響細胞氧化還原環境來調節 EMT 和 MET 相關表型之間的轉換.另一方面，MnSOD 過度表達顯著降低乳腺癌細胞的存活和生長轉移[21].
2.3 胞漿內 NADPH 氧化酶及 PKCβ/p66Shc 通路與乳腺癌
NADPH 氧化酶的催化亞基 gp91phox 及其同系 物 NOX1、 NOX3、 NOX4、 NOX5、 DUOX1、 DUOX2 被稱為 NOX 家族.當細胞接收到外源刺激時，異常激活的 NOX 家 族 蛋 白 以 NADPH/ NADH 為遞氫體進行催化反應，迅速生成高濃度的 ROS 參與誘導腫瘤的發生和發展.在這些酶催化的反應中，電子受體是氧，電子轉移反應的產物是 O2 ·，由于自發和酶促歧化，H2O2 也迅速產生. NOX1 在乳腺癌中過表達，與生長、增殖和侵襲有關;NOX4 在乳腺癌中的過表達與遷移、血管生成、糖酵解轉變和預后不良有關[22].Shen 等[23]的研究表明使用天然酶抑制 NOX1，降低了 ROS 的產生并在乳腺癌中減少了癌癥的轉移.總體而言， NOX 酶的活化或增加 NOX 表達，可以作為乳腺癌的標記物以指示其對給定的 ROS 生成的敏感性或以酶為基礎的抗性治療.
外源刺激導致胞內 ROS 升高的主要原因之一是 p66Shc 的活化.p66Shc 是 ShcA 基因編碼的蛋白質，可感受外源刺激及胞內 ROS 的水平，從 3 個方面誘導 ROS 的生成：a.在細胞核中，p66Shc 抑制 FOXO 轉錄因子的活性，導致 ROS 清除酶的表達 降 低 ， 減 少 ROS 的 清 除 ;b.在 細 胞 漿 內 ， p66Shc 可促進 racl 分子活化，誘導 NADPH 氧化酶產生 ROS，此外，p66Shc 也存在于線粒體膜間隙; c.積聚的 ROS 通過氧化應激激活 PKCβ，引起 p66Shc 磷酸化而被活化以及線粒體轉位，促進線粒體產生并釋放 H2O2，從而進一步提高細胞內 H2O2 的水平，觸發線粒體促凋亡作用.胞漿內 ROS 增加，促進 PKCβ/p66Shc 自我激活回路，維持或增加 PKCβ 的激活，從而不斷誘導胞漿中 ROS 產生[24].
3 ROS 引起的氧化應激與表觀遺傳修飾的交互影響在乳腺癌中的作用
ROS 引起的氧化應激會導致基因表觀遺傳變化，與腫瘤發生密不可分.外源刺激長期反復作用導致氧化系統失衡，導致機體長期處于過量 ROS 水平，以致引發癌癥.表觀遺傳修飾可以通過改變抗氧化酶在胞內的表達水平，影響 ROS 的清除效率;同時抗氧化酶的表觀遺傳修飾可以誘導 ROS 產生，該過程是一個 ROS 通過引起表觀遺傳修飾誘導抗氧化酶表達沉默，而減少自身清除的正反饋過程[25].機體的酶促反應是瞬時性的，而表觀遺傳修飾可以長期穩定地發揮作用，被固定下來，提供適應疾病發生的分子環境.ROS 引起的氧化應激與表觀遺傳修飾的交互影響，在乳腺癌中的作用機制如圖 2 所示.
3.1 ROS 引起的氧化應激與 DNA 甲基化
DNA 甲基化是氧化應激誘發的一個重要的表觀遺傳變化，主要表現在高甲基化引起的基因轉錄抑制(如抑癌基因)和低甲基化誘導基因轉錄激活(如癌基因)，在腫瘤發生發展中起重要作用.氧化應激會引起 CpG 島 DNA 甲基化水平降低，導致腫瘤發生[26].
ROS(特別是·OH)過量引起的氧化應激導致 DNA 損傷，阻礙了 DNA 作為甲基轉移酶的底物，也降低了 DNA 堿基對甲基的接受能力.Veeck 等[27] 證明 DNA 甲基化的異常對于正常乳腺細胞的惡性轉化起重要作用.在氧化應激引起的腫瘤中，腫瘤抑制基因是最為常見的甲基化異常位點，如在乳腺癌中腫瘤抑制基因 RB、p16INK4A、p53、BRCA1 等啟動子區域 CpG 位點均可發生高甲基化，從而使基因表達沉默[28].p53 突變的腫瘤細胞增殖與凋亡失去控制，導致無限繁殖;BRCA1 等的甲基化水平已作為乳腺癌發生的診斷工具.
3.2 ROS 引起的氧化應激與乙�；�
研究表明，表觀遺傳修飾可以調控 NOX 家族蛋白的表達從而影響癌癥的發生和發展[29].NOX2 調控機體大多數非吞噬細胞中 ROS 的產生，其表達可能受到組蛋白乙�；恼{控.已有研究表明，在 賴 氨 酸 122 處 的 MnSOD 的乙�；M物 (MnSODK122Q)可增加線粒體 ROS 水平，導致基因組不穩定并且與乳腺癌惡性腫瘤風險相關[15].
HDACi 可提高腫瘤細胞內的 ROS 水平，活化多種信號轉導途徑，啟動 DNA 應激反應，抑制腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡以發揮抗癌活性 . HDACi 在殺傷腫瘤細胞過程中 ROS 的調控機制： a.過度積累的 ROS 會破壞線粒體的膜電勢，增加線粒體膜通透性，活化 caspase 通路，誘導腫瘤細胞凋亡;b.HDACi 可以上調硫 Trx 結合蛋白 2 (TBP2)，TBP2 抑制抗氧化劑清除劑 Trx，從而提高細胞內的 ROS 水平，HDACi 引起的乙�；揎検� DNA 更易被 ROS 結合并氧化，引起 DNA 氧化損傷，發揮殺傷腫瘤細胞的作用[30].因此，可根據乳腺癌患者細胞的不同乙�；揎棸邢蛟O計 HDACi 殺傷癌細胞.
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3.3 表觀遺傳修飾調控抗氧化酶系統影響 ROS 的清除
抗氧化酶 SOD、GPx 及 CAT 受表觀遺傳修飾調控與乳腺癌的發生發展密切相關，清除效率取決于抗氧化物酶在胞內的表達水平，以及胞內 ROS 產生或累積的濃度.腫瘤發生早期階段，SOD2 發生高甲基化降低其表達量，引起胞內 ROS 增加從而促進細胞增殖;當腫瘤開始侵襲和轉移時， SOD2 甲基化水平下降，表達量上調，引起胞內 ROS 水平降低，可能更利于細胞的侵襲轉移[31]. Nelson 等[32]已經提出 MnSOD 基因表達變化與人乳腺癌細胞的增殖和遷移有關，即抑制抗氧化酶基因的表達與氧化應激引起的啟動子區高甲基化所致的基因沉默具有正相關性.有研究認為，抗氧化酶的表觀遺傳修飾可以通過 ROS 誘導產生，該過程是一個 ROS 通過表觀遺傳修飾改變誘導抗氧化酶表達沉默，繼而減少自身清除的正反饋過程[15].因此，在腫瘤發生過程中，抗氧化酶的表觀遺傳修飾改變通過影響胞內 ROS 的清除，在機體氧化平衡系統的調控中起關鍵作用.
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