發布時間：2020-01-04所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 【摘要】目的建立HPLC方法同時測定小兒退熱口服液中綠原酸、梔子苷、黃芩苷和丹皮酚含量。方法采用WelchUltimateXB-C18(250mm4.6mm，5m)色譜柱;以甲醇-0.2%磷酸為流動相，梯度洗脫;流速：1.0ml/min;檢測波長：綠原酸為330nm，梔子苷為240nm，黃芩苷、丹皮酚
【摘要】目的建立HPLC方法同時測定小兒退熱口服液中綠原酸、梔子苷、黃芩苷和丹皮酚含量。方法采用WelchUltimateXB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱;以甲醇-0.2%磷酸為流動相，梯度洗脫;流速：1.0ml/min;檢測波長：綠原酸為330nm，梔子苷為240nm，黃芩苷、丹皮酚為278nm。結果綠原酸在0.35～17.29μg/ml范圍內線性關系良好(r=1)，平均加樣回收率為100.57%，RSD為1.41%(n=6);梔子苷在2.43～121.56μg/ml范圍內線性關系良好(r=0.9999)，平均加樣回收率為99.95%，RSD為0.15%(n=6);黃芩苷在3.36～169.84μg/ml范圍內線性關系良好(r=0.9999)，平均加樣回收率為100.29%，RSD為1.17%(n=6);丹皮酚在0.51～25.18μg/ml范圍內線性關系良好(r=0.9998)，平均加樣回收率為101.06%，RSD為1.51%(n=6)。結論該方法簡單、準確、靈敏，重現性好，適用于小兒退熱口服液的質量控制。
【關鍵詞】高效液相色譜法;小兒退熱口服液;綠原酸;梔子苷;黃芩苷;丹皮酚
小兒退熱口服液主要由大青葉、板藍根、金銀花、梔子、牡丹皮、黃芩、連翹、淡竹葉等十二味中藥組成[1]，具有疏風解表、解毒利咽的功效，用于小兒外感風熱所致的感冒[2]。其中金銀花的主要藥效活性成分為綠原酸，梔子的主要藥效活性成分為梔子苷，牡丹皮的主要藥效活性成分為丹皮酚，黃芩的主要藥效活性成分為黃芩苷[3-6]。2015版《中國藥典》分別對梔子苷和黃芩苷進行含量測定[7]，而對綠原酸和丹皮酚僅進行了薄層鑒別，對于小兒退熱口服液的質量控制方法有待進一步提高。目前有報道分別測定不同制劑中綠原酸、丹皮酚、黃芩苷、梔子苷的含量[8-11]，但能夠同時對這4種成分進行測定的報道較少，為進一步提高藥品有效成分含量的穩定度，提高藥品質量，本文通過HPLC梯度洗脫體系，同時測定樣品中綠原酸、梔子苷、黃芩苷和丹皮酚的含量，建立了小兒退熱口服液中四種目標成分含量測定的HPLC方法。
1儀器與試藥
1.1儀器
Agilent1200高效液相色譜儀;Milli-QA超純水器(Millipore)，METTLERTOLEDOXS205分析天平。
1.2試藥
綠原酸對照品(批號：110753-201314)(中國藥品生物制品檢定所)、梔子苷對照品(批號：110749-200512)(中國藥品生物制品檢定所)、黃芩苷對照品(批號：110725-201321)(中國藥品生物制品檢定所)、丹皮酚對照品(批號：110708-200506)(中國藥品生物制品檢定所)，甲醇為色譜純(默克公司)，蒸餾水，其余使用試劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。小兒退熱口服液(批號：14263934、15260262、14263933，廠家：北京同仁堂科技發展股份有限公司)。
2方法
2.1含量測定
色譜條件：色譜柱為WelchUltimateXB-C18(250mm×4.6mm，5μm);流動相：甲醇(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫(洗脫梯度見表1);檢測波長：綠原酸為330nm，梔子苷為240nm，黃芩苷、丹皮酚為278nm;流速：1ml/min;柱溫：30℃;進樣量：10μl;理論板數按丹皮酚峰計算應不低于5000，詳見表1。
2.2對照品溶液制備
分別取綠原酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚對照品適量，進行精密稱定，用50%甲醇溶解，最后制備成每毫升含綠原酸10μg、梔子苷50μg、黃芩苷50μg、丹皮酚10μg的對照品溶液。
2.3供試品溶液制備
用移液管精密量取小兒退熱口服液供試品1ml，倒入25ml容量瓶，用50%甲醇逐步適量稀釋定容至所需刻度，充分搖勻，緩慢濾過，取續濾液，即得小兒退熱口服液供試品溶液。
2.4陰性樣品溶液制備
根據小兒退熱口服液處方的比例制備缺乏綠原酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚的陰性樣品，將陰性樣品按照“2.3”項下的制備方法配置成陰性樣品溶液。
2.5標準曲線制備
分別精密量取綠原酸(0.03458mg/ml)、梔子苷(0.24312mg/ml)、黃芩苷(0.33967mg/ml)、丹皮酚(0.05036mg/ml)的對照品儲備液0.1、0.2、0.5、1、2、5ml，置于10ml量瓶中，用50%甲醇逐步稀釋至所需刻度，充分搖勻，分別精密吸取10μl注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定綠原酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚峰面積，以對照品峰面積為縱坐標，對照品進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程。
3結果
3.1專屬性試驗
分別吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，注入高效液相色譜儀進行測定;圖1結果顯示：供試品中綠原酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚色譜峰與其他雜質峰達到基線分離，表明陰性樣品溶液無干擾。
3.2線性關系考察
按照方法項下2.5操作，線性范圍與回歸方程見表2。
3.3精密度試驗
同一對照品溶液精密吸取10μl，連續重復進樣6次，結果顯示綠原酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚峰面積的RSD分別為0.43%、0.20%、0.42%和0.10%，表明本法精密度良好。
3.4穩定性試驗
分別量取已制備的小兒退熱口服液供試品溶液，室溫放置，并于第0、2、4、8、12、24h進樣來測定峰面積，結果顯示綠原酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚RSD分別為0.10%、0.69%、0.55%、1.24%，表明小兒退熱口服液供試品溶液在24h內非常穩定。
3.5重現性試驗
分別量取6份同一批樣品(批號：15260262，廠家：北京同仁堂科技發展股份有限公司)，嚴格按照含量測定下方法對樣品進行平行測定，結果為：綠原酸含量為0.3550mg/ml(RSD=0.52%)，梔子苷含量為1.8115mg/ml(RSD=1.12%)，黃芩苷含量為1.8516mg/ml(RSD=1.49%)，丹皮酚含量為0.1578mg/ml(RSD=0.49%)，表明該方法測量樣品的重現性良好。
3.6回收率試驗
用量筒精密量取已知含量的樣品0.5ml(批號：15260262，廠家：北京同仁堂科技發展股份有限公司)，共取6份，分別精密加入對照品溶液(綠原酸0.1763mg/ml、梔子苷0.91115mg/ml、黃芩苷0.9167mg/ml、丹皮酚0.0724mg/ml)1ml，按照制備供試品溶液的方法進行制備，平行測定，計算回收率。結果見表3。
3.7樣品含量量
取“2.3”項下3個批號的小兒退熱口服液供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件分別進行測定，并記錄峰面積，按外標法計算各批次樣品中綠原酸、梔子苷、黃芩苷和丹皮酚的含量。測定結果：批號為14263934、15260262、14263933的3批樣品中綠原酸含量分別為0.2058mg/ml、0.3550mg/ml、0.2142mg/ml，梔子苷含量分別為1.5689mg/ml、1.8115mg/ml、1.6026mg/ml，黃芩苷含量分別為2.1586mg/ml、1.8516mg/ml、2.1780mg/ml，丹皮酚含量分別為0.2580mg/ml、0.1578mg/ml、0.2580mg/ml。
4討論
4.1色譜條件的選擇
丹皮酚和梔子苷一般采用甲醇-水體系進行分離系統，黃芩苷與綠原酸一般采用甲醇-磷酸緩沖鹽體系進行分離。實驗發現綠源酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚四種成分在甲醇-磷酸鹽緩沖體系中均峰形良好。通過考察不同比例磷酸(0.1%、0.2%、0.3%，0.4%)，發現濃度為0.2%時峰形對稱，理論塔板數較好。由于小兒退熱口服液處方藥味較多，成分比較復雜，黃芩苷與丹皮酚峰比較接近，較難分離，故采用梯度洗脫方法[12-13]。
4.2檢測波長的確定
采用Agilent工作站的DAD檢測器來進行全波長掃描，發現綠原酸在330nm，梔子苷在240nm，黃芩苷和丹皮酚在278nm波長處有最大吸收。故選擇330nm測定綠原酸，240nm測定梔子苷，278nm測定丹皮酚。
4.3供試品制備
由于小兒退熱口服液已經經過水提和醇提過程，且目標成分均為水溶性成分，只需要簡單的稀釋即可進行測定。實驗證明此方法簡單可靠，操作性高。
本實驗結果表明本文建立的HPLC方法簡單、準確、靈敏，重現性好，適用于小兒退熱口服液的質量控制。
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