發布時間：2020-12-30所屬分類：工程師職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 【摘要】目的探討臨床應用組織工程軟骨行鼻再造術的安全性及效果。方法2014年3月2015年10月，收治5例擬行全鼻再造患者。其中，1例4歲患兒為先天性鼻畸形者;其余4例成年患者為外傷所致鼻部亞單位缺損，男3例，女1例;年齡24～33歲，平均28.5歲。以鼻中隔軟骨(
【摘要】目的探討臨床應用組織工程軟骨行鼻再造術的安全性及效果。方法2014年3月—2015年10月，收治5例擬行全鼻再造患者。其中，1例4歲患兒為先天性鼻畸形者;其余4例成年患者為外傷所致鼻部亞單位缺損，男3例，女1例;年齡24～33歲，平均28.5歲。以鼻中隔軟骨(兒童)或耳軟骨(成人)來源的種子細胞來源與聚羥基乙酸(poly-glycolicacid，PGA)-聚乳酸(poly-lacticacid，PLA)支架復合培養，在體外構建組織工程軟骨。1例患兒一期行鼻部畸形矯正術、硅膠假體植入術，二期取出假體同時植入組織工程軟骨;其余4例成年患者均采用額部皮瓣擴張法行鼻再造。鼻再造術后患者行1～4次鼻修整術;術中對植入的組織工程軟骨進行觀察，其中2例取材行組織學觀察。結果術后3例患者出現低熱;額部擴張皮瓣均成活，切口均Ⅰ期愈合，無感染、明顯排斥反應、組織工程軟骨外露等并發癥發生。額部供區切口均Ⅰ期愈合。患者均獲隨訪，隨訪時間9～74個月，平均54.8個月。隨訪期間患者鼻部無明顯不適，通氣功能良好，對鼻部外形基本滿意。組織工程軟骨組織學觀察示術后早期1例出現明顯鈣化，另1例有軟骨存在;術后遠期1例呈纖維結締組織表現，另1例仍有軟骨存留。結論臨床應用初步證明使用組織工程軟骨行鼻再造安全，但其有效性仍需進一步驗證。
【關鍵詞】組織工程軟骨;鼻再造;鼻缺損;鼻畸形
鼻位于面部中央，外鼻缺損或畸形對人的外貌有著顯著影響。鼻再造是修復鼻缺損或矯正鼻畸形的主要方法，外被、支架和襯里是鼻再造的3個重要組成部分[1]。支架是整個再造鼻的骨架核心，是將二維皮瓣轉化為三維立體結構的關鍵。本課題組前期采用3D打印技術在體外成功構建具有精細結構的組織工程鼻翼軟骨[2]。為進一步探索該組織工程軟骨用于鼻再造的安全性和有效性，2014年3月—2015年10月我們將其用于治療5例鼻缺損或畸形患者�，F回顧5例患者治療過程，總結臨床觀察結果，為今后研究提供參考。
1臨床資料
1.1一般資料
本組1例4歲患兒為先天性鼻畸形。其余4例成年患者為外傷所致鼻部亞單位缺損，男3例、女1例;年齡24～33歲，平均28.5歲。既往均未對鼻畸形或缺損進行修復。臨床資料詳見表1。
1.2組織工程軟骨構建
1.2.1種子細胞培養 局麻下，成年患者取耳甲腔軟骨約0.12mL，兒童取鼻中隔軟骨約0.013mL，置于0～4℃培養液中，即刻轉送至實驗室。使用酶消化法獲得原代人耳軟骨細胞/鼻中隔軟骨細胞，用含H-DMEM培養基(GIBCO公司，美國)、5.0ng/mLbFGF(R&D公司，美國)、10%FBS(HyClone公司，美國)的完全培養基制成細胞懸液，以1.5×104個/cm2密度接種后，置于37℃、5%CO2及100%飽和濕度的培養箱內培養。待細胞生長匯合至70%～80%進行傳代，收集第2代軟骨細胞，備用。
1.2.2組織工程軟骨構建�、賾�3D打印技術制備與正常鼻翼、鼻背形態相似的塑料支架，利用塑料支架制備石膏陽模與陰模。
�、诓捎镁哿u基乙酸(poly-glycolicacid，PGA)-聚乳酸(poly-lacticacid，PLA)復合材料構建組織工程軟骨支架。其中，PGA分子量約30000，由上海組織工程國家工程中心提供;PLA分子量約10000，購于美國Sigma-Aldrich公司。將無紡的絮狀PGA纖維均勻鋪在石膏陽模上，反復滴加含0.5%PLA的二氯甲烷溶液，至PLA干重占支架材料總質量的15%;待二氯甲烷大部分揮發后，扣上陰模加壓使其成型。
�、郛斨苽涞腜GA-PLA材料達所需強度時，取出并修剪周圍多余材料，獲得相應形態的支架。將支架材料置于75%乙醇浸泡1h、紫外線照射30min消毒，無血清DMSM培養液洗滌5次，加入常規細胞培養液預培養48h，確定無污染后吸干培養液備用。
�、苋�1.2.1制備的第2代軟骨細胞，調整細胞濃度至1×106個/mL后接種于PGA-PLA支架材料上;采用軟骨重分化培養液，于37℃、5%CO2及100%飽和濕度條件下培養12周，體外構建組織工程軟骨。培養結束后，將其行HE染色檢測，確定無感染后植入人體內。其中，早期收治的例1、2組織工程軟骨制備為片狀，為進一步縮短術中支架雕刻時間，例3、4、5將再造鼻背部分的組織工程軟骨形狀改為與隆鼻用硅膠L型支架一致。
1.3手術方法
本組1例先天性鼻畸形患兒一期行鼻部畸形矯正術、硅膠假體植入術，二期取出假體同時植入組織工程軟骨;其余4例成年患者均采用額部皮瓣擴張法進行鼻再造。
1.3.1一期手術 一期行額部擴張器植入。全麻下，標記發際內切口線及擴張器置入范圍。切開皮膚，在皮下層進行剝離，在帽狀腱膜下層分離至預定范圍。4例成年患者均置入300mL橢圓形擴張器，留置引流管1根，適當加壓包扎。本組例4同時行鼻孔開大術。
術后14d切口愈合后拆線。拆線后1周開始向擴張器內注水，每周注水2次，每次注水15～20mL，待總注水量達600～750mL后停止注水并靜置1個月。注水及靜置共耗時5～6個月，平均5.75個月。
1.3.2二期手術
二期行全鼻再造。全麻下，于鼻部受區切開松解瘢痕，依據局部瘢痕及黏膜情況制作襯里皮瓣，于鼻背正中皮下徹底松解組織，并于骨膜上方剝離形成腔隙。然后取出擴張器，設計額部帶蒂皮瓣。局麻后，切開皮瓣按照蒂部扭轉方位向下旋轉皮瓣至受區。將構建的組織工程軟骨適當修剪，分別置于鼻翼及鼻背，并與周圍組織固定。將皮瓣與制備的襯里皮瓣縫合，縫合額部供區。
術后放置引流管，密切觀察皮瓣血運及引流情況，2d后拔出引流管，14d后拆線。術后1個月開始使用腸鉗夾持再造鼻蒂部血運進行鍛煉，待血運阻斷可達2h以上時，行三期皮瓣斷蒂術。
1.3.3三期手術
三期行皮瓣斷蒂術。全麻后，患者取平臥位，采用局部浸潤麻醉后切斷鼻根蒂部，舒展皮瓣，形成鼻根，并將多余的蒂部組織剖開形成皮瓣，與額部受區分層縫合。斷蒂后6個月左右水腫消退、皮瓣收縮和瘢痕穩定后[3]，根據患者鼻部外形行再造鼻修整術，包括修薄皮瓣形成鼻部精細結構、調整軟骨支架、修復切口瘢痕等。本組5例患者行1～4次鼻修整術，平均2.2次。
1.4組織學觀察本組
2例患者鼻修整術中取組織工程軟骨進行組織學觀察，其中例3分別于術后1年半、5年取材，例4分別于術后4年、5年進行取材。上述標本均行HE染色、EvG彈性纖維染色以及Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色。為方便表述，以術后早期(植入時間<2年)和遠期(植入時間>2年)來區分。
2結果
2.1臨床觀察結果
4例成年患者二期術后72h內皮瓣遠端均未出現靜脈淤血現象，皮瓣均全部成活，切口Ⅰ期愈合，無急性期感染、明顯排斥反應等并發癥發生。額部供區切口均Ⅰ期愈合。4例成年患者中，2例患者(例3、例4)術后出現一過性低熱，未予特殊處理，自行緩解;2例患者(例1、例2)鼻部腫脹程度較其余2例明顯，經常規口服消腫藥物處理后，切口均按時拆線。另1例患兒(例5)二期組織工程軟骨植入術后出現持續性低熱，鼻部腫脹明顯，術后2d拔出引流管后引流管口延遲愈合，滲出液較多，取分泌物細菌培養陰性;6d時體溫突然升高，考慮為扁桃體炎，對癥予抗生素治療后體溫恢復正常，切口按時拆線。
術后5例患者均獲隨訪，隨訪時間9～74個月，平均54.8個月。隨訪期間患者鼻部無明顯不適，無組織工程軟骨感染、移位或變形等并發癥發生，鼻部形態明顯改善，皮瓣色澤與正常皮膚相似，質地柔軟，鼻部無明顯通氣障礙。患者對鼻部外形基本滿意。見圖1、2。
2.2組織學檢測結果
鏡下觀察：術后早期(例3)取材HE染色可見散在的軟骨組織結構，EvG彈性纖維染色陽性，Ⅰ型膠原免疫組織化學染色陽性，Ⅱ型膠原免疫組織化學染色為弱陽性。其余大部分與纖維結締組織表現相同，可見散在的無結構組織，旁邊可見多核巨噬細胞浸潤，考慮為PGA-PLA殘余支架成分。術后遠期取材中，例3患者HE染色呈纖維結締組織特點，未見明顯軟骨組織結構，EvG彈性纖維染色呈陰性，Ⅰ型膠原免疫組織化學染色呈強陽性，Ⅱ型膠原免疫組織化學染色呈陰性，同樣可見散在的無結構組織。例4患者取材中，1個標本呈明顯骨化表現，另1個標本中可見明顯軟骨組織結構，HE染色、EvG彈性纖維染色以及Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色結果則與例3術后早期結果相似。見圖3。
3討論
理想化的鼻部組織工程軟骨是能在減少患者損傷的同時，提供更好的支架材料，降低手術難度，減少手術時間和鼻修整次數。Fulco等[4]首次在癌癥術后患者中使用片狀組織工程軟骨進行單側鼻翼重建，獲得了較好的鼻翼功能與外形重建。除此之外，其他用于鼻部的組織工程軟骨人體體內研究非常有限[5]。
在我們臨床試驗中，經過5年的術后隨訪，已初步證實了自體耳軟骨細胞或鼻中隔軟骨細胞復合PGA-PLA支架體外構建的組織工程軟骨在鼻再造中的安全性。在3D打印技術輔助下，可以近乎精確地獲得鼻翼和鼻背形狀的組織工程軟骨，但是隨訪發現植入后仍存在一些問題。組織學檢測顯示，組織工程軟骨在植入鼻部后，軟骨組織逐漸被吸收，取而代之的是纖維結締組織，有少量的PGA-PLA支架材料殘留。例4患者組織工程軟骨植入體內8個月后就出現了明顯的鈣化現象[6]，但具體原因尚不知曉。在本課題組同期進行的組織工程軟骨耳廓再造臨床試驗中，結果顯示軟骨支架移植入體內最早2個月就開始出現變形、坍塌，解剖結構模糊，MRI也顯示植入的軟骨被吸收[7-8]。盡管植入的組織工程軟骨外形和力學性能尚可滿足臨床需求，但植入體內后出現的這種吸收、纖維化及鈣化趨勢，必然會導致不可預測的剛度變化及原位變形，并最終對頭面部再造器官的外形產生影響。已有研究證實軟骨微環境及種子細胞來源均對再生軟骨類型有一定調控作用[9]，肋軟骨來源種子細胞構建的組織工程軟骨會表現出肋軟骨的骨化傾向[10]。但是，目前對于維持組織工程軟骨機變性的特異性生化成分尚不清楚，細胞生化、免疫學以及生物力學間的復雜關系也需進一步研究。
例5患兒在組織工程軟骨植入后出現低熱、鼻部腫脹、滲出液增多等情況，但分泌物細菌培養為陰性，因組織工程軟骨的種子細胞為自體來源，所以考慮無菌性炎癥可能是由支架材料的體內代謝或其他相關因素引起的。本試驗中采用PGA和PLA作為支架材料，其在降解過程中產生的低pH環境會影響軟骨細胞的生長、增殖和表型的維持，甚至導致細胞壞死[11]。在軟骨構建過程，只有細胞材料復合物體外培養階段，PGA-PLA支架未能充分降解，且該材料在人體內降解速度極為緩慢，即使在術后5年，構建的組織工程軟骨中仍存在散在的支架材料未被降解。
與傳統的肋軟骨鼻再造法相比，采用組織工程軟骨行鼻再造降低了受區損傷，同時因為避免了繁瑣的肋軟骨支架搭建，大大縮短手術時間，根據目前患者隨訪情況，遠期手術效果與肋軟骨支架鼻再造法無明顯差異。但組織工程軟骨構建較繁瑣、價格昂貴，其在鼻再造中的應用仍處于探索階段，距臨床推廣應用仍有一定差距。
要實現組織工程軟骨在頭面部器官重建中的大規模臨床應用，需要解決更多問題。例如，如何解決組織工程軟骨纖維化及骨化、如何將可能引發的免疫反應和炎癥控制在最小。針對以上問題，我們依據組織工程三要素總結了可能的解決措施。①種子細胞。除成體軟骨細胞外，BMSCs和脂肪MSCs也具有成軟骨能力，它們是目前種子細胞的研究熱點。有必要對MSCs分化調控及遠期轉歸進行研究，以避免可能存在的風險[5]。②支架材料。為避免上述支架材料植入體內后的不良反應可不使用支架，采用細胞膜片技術[12]進行組織工程軟骨的培養;或不植入支架，即加快支架材料在體外培養階段的代謝速率;或者探索其他新的支架材料。通過不同方式提高天然材料的可塑性及力學強度，或將天然材料和人工合成材料進行復合，從而獲得組織相容性較好、形態可控、力學性能合適的復合材料[13]，如聚乳酸-羥基乙酸共聚物/脫細胞軟骨細胞外基質支架材料、殼聚糖/絲素蛋白/納米羥基磷灰石多層支架復合體[14]等，但這些支架材料在人體內的長期安全性及用于頭面部器官重建的有效性尚不明確。③培養條件。動態培養環境比靜態培養環境能更好地模擬人體內狀態，動態生物反應器因而也更適宜組織工程軟骨組織的生長。不同的種子細胞來源及所構建的軟骨用途不同，所適宜的最佳動態軟骨培養條件也存在差異[15]。本課題組自主研發了一種組合式組織工程動態培養儀[16]，但構建鼻部組織工程軟骨的具體條件仍在進一步探索。
綜上述，盡管已經初步證實了組織工程軟骨行鼻再造術的安全性，但其有效性仍需進一步驗證。為確保組織工程軟骨在長期植入體內后仍能有足夠的軟骨存留，提高體外構建軟骨的質量及功能是后續研究的重要方向。——論文作者：任朋潔，徐奕昊，范飛，田樂，陸曉娜，尤建軍，王歡，鄭若冰
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