發布時間：2021-11-15所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：PVC(聚氯乙烯)塑料是世界第三大合成聚合塑料，對其進行無害化處理一直是一項難題。為研究黃粉蟲取食PVC塑料膜對其生長發育的影響并探究其腸道中對PVC降解起關鍵作用的微生物，以PVC塑料喂食黃粉蟲，每三天記錄存活的黃粉蟲數量、PVC膜重量和黃粉蟲凈重，60天后取
摘要：PVC(聚氯乙烯)塑料是世界第三大合成聚合塑料，對其進行無害化處理一直是一項難題。為研究黃粉蟲取食PVC塑料膜對其生長發育的影響并探究其腸道中對PVC降解起關鍵作用的微生物，以PVC塑料喂食黃粉蟲，每三天記錄存活的黃粉蟲數量、PVC膜重量和黃粉蟲凈重，60天后取腸道內容物對16SrRNA基因進行PCR擴增和高通量測序，分析腸道菌群結構變化。研究發現PVC組黃粉蟲可正常生長，PVC膜失重率達到41.6%，但存活率、化蛹率和體重增長率顯著低于麥麩組。屬水平上，PVC組中優勢菌種為Spiroplasma(74.44%)、Bacteroides(1.61%)、Escherichia-Shigella(1.18%)和Enterococcus(1.16%)。結果表明，黃粉蟲可通過取食PVC膜獲取能量，但尚不能完全滿足其生長發育需要，其腸道菌群結構發生明顯變化，為今后進一步研究多菌種協同降解PVC塑料奠定了基礎。
關鍵詞：環境工程學;黃粉蟲;生物降解;聚氯乙烯;腸道微生物;多樣性
聚氯乙烯(PVC)為世界上第三大合成聚合塑料，且難以被生物所降解[1]，填埋和焚燒是目前塑料廢物的主要處理方式[2]，但均會不同程度的對環境造成二次污染[3-4]，對其進行無害化處理一直是一項難題。生物處理技術是通過生物代謝過程將廢物轉化成二氧化碳、水和生物質等最終產物進入地球化學循環中，具有降解高效和成本經濟的特點，被認為是處理白色污染最具持續性的處理方式[5]。
腸道微生物是豐富的微生物資源庫，目前昆蟲腸道微生物正成為塑料降解菌株的重要來源[6-8]。黃粉蟲(Tenebriomolitor)俗稱面包蟲，全變態發育，幼蟲體長28mm−32mm，現已被人工大量飼養用作特種養殖。2011年，沈葉紅[9]最先對黃粉蟲幼蟲嚙食聚苯乙烯的現象進行了研究，并從腸道中分離出8株菌，但這8株菌并不能單獨降解聚苯乙烯。2015年，Yang等[10]首次證實黃粉蟲幼蟲能嚙食并消化聚苯乙烯泡沫塑料，并在幼蟲腸道中分離出一株微小桿菌YT2(Exiguobacteriumsp.YT2)，該菌在液體培養60d的條件下，能夠降解7.4%±0.4%的聚苯乙烯。2020年，PengBoyu等[11-12]最先證實黃粉蟲幼蟲是通過其腸道微生物的作用對PVC進行降解。昆蟲腸道中的微生物對食物的降解往往是一個多菌種協同降解的過程[13]，且對于難降解有機物多菌種協同往往能獲得比單一菌種更好的降解效果[14]�？v觀已有研究，雖然證實了黃粉蟲腸道微生物在降解塑料過程中的重要作用，但對于這一過程中哪些微生物可能參與其中并未深入研究。
鑒于此，本文從黃粉蟲取食PVC塑料這一現象出發，研究黃粉蟲取食PVC塑料膜后對其生長發育和腸道微生物菌群結構的影響，找出其中的差異微生物，為將來利用多菌種協同降解塑料做初步探索。
1試驗部分
1.1試驗材料
試驗用黃粉蟲購于南昌千花伴花鳥市場。
1.2主要試劑和儀器
PVC(聚氯乙烯)膜：臨沂市奔多包裝有限公司;RAeasyMiniKit(50)DNA提取試劑盒：QIAGEN;203443TaqDNA聚合酶：QIAGEN;T100PCR儀：Bio-rad;EPS-600電泳儀：Tanon;3500凝膠成像儀：Tanon;Novaseq測序儀，illumina;5810R臺式高速離心機，Eppendorf;QIAxtractor高通量核酸純化工作站，QIAGEN;2100Bioanalyzer生物芯片分析系統，Aglient;NanoDrop2000c微量分光光度計，ThermoFisher。
1.3試驗方法
1.3.1黃粉蟲的飼養
隨機挑選體長在2cm左右的黃粉蟲30條，置于90mm玻璃培養皿中，在室溫(25±2)℃下培養，試驗開始前，先用麥麩飼養3天，之后將培養皿清掃干凈，用PVC塑料膜作為唯一食物，每隔5天噴灑無菌水補充水分，另外以喂食麥麩的黃粉蟲作為對照，每組設置3個重復。每天及時清理死亡的黃粉蟲尸體，每3天記錄一次存活的黃粉蟲數量、PVC膜重量和黃粉蟲凈重。
1.3.2腸道內容物的提取
飼養60天后，從麥麩組和PVC組中隨機挑選15只黃粉蟲，過95%酒精后點燃表皮進行滅菌。用無菌鑷子夾住黃粉蟲尾部與第二對足部以上部分，拖拉取出完整腸道，同組16只黃粉蟲的腸道混合作為1個樣本收集在無菌離心管中，于80℃冰箱中保存。
1.3.3樣本基因組DNA的提取、PCR擴增與高通量測序
采用DNeasyPowerSoilKitDNA提取試劑盒抽提樣本總DNA寄送至上海歐易生物醫學科技有限公司進行后續PCR擴增及測序工作。以帶barcode的通用引物:343F-5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'(前端);798R-5'-AGGGTATCTAATCCT-3'(后端)擴增各樣本總DNA上16SrRNA基因的V3–V4高變區序列。PCR擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后使用磁珠純化，純化后作為二輪PCR模板，并進行二輪PCR擴增，并再次使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后對PCR產物進行Qubit定量。根據PCR產物濃度進行等量混樣后進行測序。
1.3.4測序數據分析
測序基于illuminaNovaseq平臺，先后利用Trimmomatic(version0.35)軟件、Flash(version1.2.11)[15]軟件、QIIME中的split_libraries(version1.8.0)[16]軟件和UCHIME(version2.4.2)[17]軟件對原始數據進行質控處理，去除不合格的堿基，按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行操作分類單元(optionaltaxonomicunit,OTU)聚類，選取每個OTU中豐度最高的序列為代表序列。采用RDPclassifierNaiveBayesian分類算法[18]對獲得的OTU代表序列作分類學分析(置信度閾值為0.8)，選用Silva數據庫進行物種比對注釋。為消除因測序深度不同所引起樣本間的多樣性評估偏差，將各樣品所測得的有效序列數抽平(均一化)處理后再進行后續分析。基于OTU數據計算各樣品中細菌群落的多樣性指數，并采用基于BrayCurtis距離矩陣算法比較各樣品間細菌類群的組成差異。
2結果與討論
2.1黃粉蟲對PVC塑料膜的消化降解
試驗過程中觀察到黃粉蟲可取食PVC塑料膜，見圖1，被取食后的PVC膜周邊呈現明顯的不規則形狀，見圖2。膜重量從初始的0.1136g減少到0.0663g，18天失重率達到41.6%，減重明顯，見圖3。在前3天，PVC膜重量減少較快，第3天時失重率達到10.2%，之后PVC膜重量仍在減少，但減少的速度有所放緩，第15天時，減少的速度又有所上升，第18天時，失重率達到47.4%。
2.2取食PVC膜對黃粉蟲生長發育的影響
黃粉蟲單體平均體重在整個試驗過程中是增加的，見圖4(a)，但該過程分為3個階段，在開始的6天里，單體平均體重呈現增長態勢，但增長率顯著小于對照組;第6天至第15天，單體平均體重有所下降;第15天開始又恢復增長，但增長速度明顯下降。通過對PVC失重率的變化和黃粉蟲單體平均體重的變化進行分析，我們發現兩者呈一定的相關性，其原因可能在于開始的6天里，黃粉蟲體內輔助PVC膜塑料降解的營養元素較為充足，因此能大量取食PVC塑料并轉化為自己的身體重量，隨著營養元素的消耗，PVC膜的攝取量開始減少，黃粉蟲體重也隨之下降，之后，黃粉蟲腸道內微生物適應了以PVC膜作為單一營養來源，黃粉蟲體重開始緩慢增長。雖然PVC組單體重量在試驗過程中是增長的(18天增長率30.8%)，但其增長幅度遠小于對照組(18天增長率75.7%)，從圖4(b)、圖4(c)可以看出存活率(83.3%)、化蛹率(0%)也顯著小于對照組(存活率97.2%，化蛹率19.4%)，這可能是與麥麩相比，PVC膜所提供的能量與營養并不充分。
2.3取食PVC膜對黃粉蟲腸道微生物多樣性的影響
2.3.1腸道微生物α多樣性變化
項目2組(8個)樣本，得到validtags(即最終用于分析的數據)數據量分布在74018~88499之間，組間(克隆)文庫的平均覆蓋率為99.66%−99.72%(表1)，同時，稀釋曲線趨于平緩，見圖5，這表明樣本測序數據量趨于飽和，各組所測得的數據能真實反映樣本中絕大多數細菌類群的組成情況。
相關期刊推薦：《安全與環境學報》雙月刊，主要刊載石油、化工、生態、環境、礦業、信息、網絡、冶金、建筑、交通、勘探、國防等領域的相關論文。設有：環境化學、污染控制技術與原理、區域環境與生態、環境監測、廢物處理與資源化、安全原理、安全工程、公共安全等欄目。
將所有樣本測得的有效序列抽平處理后，得到的OTU總數為2196個，其中PVC組樣品所測得的OTU數為1787個，對照組樣品所測得的OTU數為1279個，兩組共有的OTU數為870個，見圖6。這說明兩組樣品所檢測到的細菌類群在OTU水平上存在差異。α多樣性分析結果表明：PVC組中細菌群落的豐富度(以Chao1指數來衡量，PVC組Chao1=1066.79±45.10，麥麩組Chao1=898.67±53.09)高于對照組，但其細菌群落的多樣性(以Shannon指數“H”與Simpson指數“C”來衡量，PVC組H=2.11±0.30，C=0.33±0.05;麥麩組H=3.59±0.09，C=0.85±0.02)卻明顯低于對照組，見表1。這表明，PVC塑料可能誘導了黃粉蟲腸道中一些與PVC降解相關的微生物的繁殖，由于PVC結構的復雜性，這些微生物可能只是參與了其中的一個步驟，且數量不是很多，與此同時，與PVC塑料降解過程無關的微生物逐漸減少，導致多樣性指數降低。
2.3.2腸道微生物β多樣性變化
為進一步了解取食PVC塑料和取食麥麩兩組黃粉蟲腸道菌群結構差異，在OTU水平上，基于樣本間相似性距離，對所有樣本進行二維主坐標分析(PCoA分析)，PVC組樣本和對照組樣本距離較遠，說明其微生物群落組成存在差異，見圖7。進一步，采用Bray-curtis和Binary-jaccard兩種距離矩陣進行Adonis(多元方差)分析，以檢驗分組差異是否顯著，R2越大說明該分組方案對差異的解釋度越高，Pr小于0.05時說明本次檢驗的可信度高。在采用Bray-curtis距離矩陣，即只考慮物種豐度時，R2=0.562，P=0.025;在采用Binary-jaccard距離矩陣，即只考慮物種是否存在時，R2=0.209，P=0.030，見表2�？梢�，無論是僅考慮物種豐度還是僅考慮物種是否存在時，兩組腸道菌群均有顯著差異，差異具有統計學意義。說明黃粉蟲取食PVC塑料后，腸道菌群發生了顯著改變。
2.3.3腸道微生物群落組成變化
昆蟲腸道中棲息的微生物群體數量極其龐大，它們協助宿主對食物進行消化[19-23]。昆蟲的腸道微生物群落具有種內和種間水平上的高度差異性和類群多樣性[24]。在門水平上PVC組中優勢菌種依次為軟壁菌門(Tenericutes，豐度74.46%)、變形菌門(Proteobacteria，豐度9.39%)硬壁菌門(Firmicutes，豐度8.69%)和擬桿菌門(Bacteroidetes，豐度5.90%);對照組中優勢菌種為硬壁菌門(Firmicutes，豐度51.37%)、變形菌門(Proteobacteria，豐度39.40%)、軟壁菌門(Tenericutes，豐度8.06%)和擬桿菌門(Bacteroidetes，豐度0.76%)，見圖9。在屬水平上，PVC組中優勢菌種依次為螺原體(Spiroplasma，豐度74.44%)、擬桿菌(Bacteroides，豐度1.61%)、大腸桿菌志賀氏菌(Escherichia-Shigella，豐度1.18%)和腸球菌(Enterococcus，豐度1.16%)，麥麩組中優勢菌種為乳球菌(Lactococcus，豐度15.28%)、梭狀芽孢桿菌(Clostridium_sensu_stricto_6，豐度11.87%)、魏斯氏菌(Weissella，豐度10.47%)和螺原體(Spiroplasma，豐度8.06%)，見圖8。由此可以看出，兩組樣本菌群結構明顯不同。之前有研究表明，取食PE的昆蟲腸道內的高豐度菌群主要是Sebaldellatermitidis，Brevibacteriumsp.，取食PS的昆蟲腸道內的高豐度菌群主要是Alcaligenes，Brevundimonas，Myroides，Listeriasp.，Nitrospiradefluvii，Pedomicrobiumsp.，Aquihabitanssp.，unclassfiedXanthomonadaceae，unclassifiedSaprospiraceae，unclassifiedBurkholeriales[25-26]。本研究發現，取食PVC塑料的黃粉蟲腸道菌群結構與取食PE和PS的腸道菌群結構不同，這可能是由于不同塑料的分子結構不同造成參與降解的菌種不同所致。
2.3.4腸道菌群差異物種分析
由于群落組成分析側重于高豐度物種的變化趨勢，但是有些物種雖然豐度較低，但是組間差異較大，通過LEfSe分析可以兼顧組間存在差異的高峰度物種和低豐度物種，找出組間差異指示物種。通過對PVC組和對照組內樣品進行LEfSe分析，在屬水平上發現了兩組中分別對腸道菌群結構差異性影響較大的微生物。圖9中顯示了PVC組和對照組內的樣本基于LDA分值分析得到的柱狀圖，柱狀圖中展示了兩個組別中分別對菌群結構差異貢獻較大的標志性微生物，可以看到PVC組中對菌群結構差異影響較大的優勢菌為Spiroplasma、Bacteroides、Faecalibacterium和Comamonas，而對照組中的優勢菌為Lactococcus、Weissella、Staphylococcus和Pediococcus。螺原體(Spiroplasma)作為昆蟲腸道內常見的微生物[27]，目前尚未有螺原體參與塑料降解的報道，但有研究表明，昆蟲腸道內的螺原體具有合成能源物質乙酸的及抵御外來細菌入侵的作用。如Leaderbetter等從低等白蟻腸道內分離到密螺原體屬的三種螺原體ZAS-1、ZAS-2和ZAS-9，并且證明ZAS-1和ZAS-2具有還原產乙酸的功能[28]。VeiverPC，O'BrienRW，StaytorM等通過給白蟻喂食甲硝基羥己唑(滅滴靈)或把它們培養于純氧條件下消除腸道中的螺原體，白蟻存活時間明顯縮短，并且腸道中有非土著細菌的入侵[29]，因此在本研究中螺原體是直接參與了PVC塑料的降解過程還是通過內共生體的相互作用使得取食PVC塑料的黃粉蟲具有了利用營養匱乏食物資源、抵御外來入侵、提高繁殖的能力還有待進一步研究。Zhang等對新疆棉田采集的微塑料進行了分析，發現塑料碎片表面富集了一些降解聚乙烯的類群，其中就包含了Bacteroides，并認為微塑料上微生物之間的生物相互作用中，酸桿菌(Acidobacteria)、厚壁菌門(Gemmatimonadetes)和擬桿菌(Bacteroidetes)是最重要的物種[30]。王玉軍等，從施用過五氯硝基苯(PCNB)的土壤中分離得到1株高效菌株-吉氏擬桿菌(Bacteroidesdistasonis)，并對生長條件和降解機理進行了初步研究，結果表明該菌依靠共代謝作用還原PCNB，在培養液和土懸液條件下均能加速PCNB的降解[31]。李湛江等，從一些下水道底泥中篩選分離、馴化得到2株厭氧降解硝基苯高效菌吉氏擬桿菌(Bacteroidesdistasonis)和屎擬桿菌(Bacteroidesmerdae)，能與葡萄糖共代謝還原硝基苯，該菌最大降解硝基苯的速率為95mg/(L·d)[32]。以上研究成果說明PVC組中的擬桿菌(Bacteroidetes)對PVC塑料有一定的降解潛力。在本研究中，Comamonas僅從豐度上來看在PVC組不高，只有0.395%，但其對PVC組的菌群結構差異貢獻較大，而在對照組中豐度極低，僅為0.0131%，已有的研究表明該菌可降解多種石油污染物，如催明超等研究了睪丸酮叢毛單胞菌Q10對喹啉類化合物的降解，發現喹啉和3-甲基喹啉不僅能有效地被降解,而且細菌也有明顯的生長[33]。張立志等自大連某污水處理廠活性污泥中分離菌株Comamonassp.Z1，36h內能將25-75mg/L鄰甲酚、25-200mg/L對甲酚完全降解[34]。OkaiM等從日本川崎港某公園的底泥水中分離出了一種降解5環多環芳烴二苯并蒽(DBA)的Comamonassp.該菌在7d內降解了DBA(30μg/ml)的29%，該菌株還能降解芘(Pyr)、苯并[b]熒蒽(BbF)、苯并[k]熒蒽(BkF)和苯并[g,h,i]苝(BghiP)分別40、14、15和19%[35]。此外，Comamonas還對2-吡啶甲酸[36]、阿特拉津[37]、活性偶氮染料[38]等具有良好的降解能力。因此，該菌很可能也是重要的PVC降解菌。綜合上述研究成果，Spiroplasma、Bacteroidetes和Comamonas很可能都參與了PVC的降解過程，這符合在自然環境中，復雜、難降解有機物的降解過程往往是由多個菌種協同代謝完成的這一特點[39]，但以上幾種微生物具體參與了PVC降解過程中哪一步，以及它們之間在代謝路徑上存在怎樣的相互關聯，未來還需要進一步做深入研究。
3結論
(1)黃粉蟲可取食PVC塑料膜并從中獲取一定的能量，PVC膜重量從初始的0.1136g減少到0.0663g，18天失重率達到41.6%，蟲體平均體重增長率為30.8%，存活率為83.3%,化蛹率為0%。
(2)黃粉蟲取食PVC膜后，其腸道微生物多樣性顯著降低，Shannon指數與Simpson指數分別由對照組的3.59±0.09和0.85±0.02降低至2.11±0.30和0.33±0.05。
(3)取食PVC塑料后黃粉蟲腸道中原有的菌群結構發生顯著改變。在屬水平上，取食PVC塑料的黃粉蟲腸道中的優勢菌種為Spiroplasma(74.44%)、Bacteroides(1.61%)、Escherichia-Shigella(1.18%)和Enterococcus(1.16%)，對腸道菌群結構差異影響較大的菌種為Spiroplasma、Bacteroides、Faecalibacterium和Comamonas，這為今后進一步研究多菌種協同降解PVC塑料奠定了基礎。——論文作者：徐健全1*，楊愛玉1，歐陽勇1，張燕1，胡文靜1，曾建立2
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