發布時間：2021-09-15所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：本文建立了一種基于離子色譜分離/抑制型電導檢測的分析方法，用于測定甲殼類水產品中殘留的草酸含量。樣品經過超純水超聲提取30min，雜質沉淀后，上清液首先通過聚二乙烯基苯固相萃取柱，然后通過包含銀鹽形式及H+型的強酸型聚苯乙烯型的陽離子交換樹
摘要：本文建立了一種基于離子色譜分離/抑制型電導檢測的分析方法，用于測定甲殼類水產品中殘留的草酸含量。樣品經過超純水超聲提取30min，雜質沉淀后，上清液首先通過聚二乙烯基苯固相萃取柱，然后通過包含銀鹽形式及H+型的強酸型聚苯乙烯型的陽離子交換樹脂柱凈化，經IonPacAS11-HC高容量羥基選擇性陰離子交換色譜柱分離，氫氧根淋洗液發生器(EG)產生洗脫液進行梯度淋洗，外加水模式在線抑制，電導檢測器測定。結果表明草酸在0.05~10.00mg/L范圍內線性相關良好(相關系數為0.9998)，方法的檢出限為0.033~0.041mg/kg，定量限為0.11~0.14mg/kg，回收率為75.71%~88.85%，日內精密度(n=6)為1.74%~3.61%，日間精密度(n=5)小于5%。該分析方法高效靈敏，準確可靠，適用于甲殼類水產品中草酸殘留量的檢測確證，并為政府監管提供數據支持。
關鍵詞：離子色譜法;外加水模式電導檢測;草酸;甲殼類水產品;固相萃取凈化
《中國水產》發布的《2019年全國漁業經濟統計公報》[1]顯示，2019年甲殼類水產咸(淡)水養殖產量高達567.44萬t，產量及消費量巨大，且呈增長的趨勢。不法商販為了讓小龍蝦看上去干凈透亮、節省清洗時間，常常會使用“洗蝦粉”對甲殼類水產進行清洗。該物質為白色粉末且具有刺激性氣味，使用操作簡便，對甲殼類水產的清潔快速高效，能在較短時間內洗凈污物[2]，且甲殼類水產外表色澤鮮亮、易于出售。
研究表明，“洗蝦粉”主要成分為檸檬酸、亞硫酸鹽和草酸[3,4]，其中草酸作為一種化工生產原料，根據我國GB2760-2014《食品添加劑使用標準》規定不允許用于食品中。此外草酸也可作為水體污染物遷移到甲殼類水產品。消費者進食大量經草酸處理的甲殼類水產品時，容易出現高草酸血癥，心肌或傳導系統會受到體內草酸過多的影響，并誘發心力衰竭和致命性心律失常[5]。
國內外關于草酸含量測定的方法主要集中在色譜分析方法[6-8]、光譜分析方法[9]及酶聯免疫定性法[10,11]。其中分光光度法(光譜法)主要通過化學反應，根據吸光度變化對草酸進行檢測，相對色譜法便宜，但靈敏度不足。顯色法和酶聯免疫法則一般只適用于定性分析，無法對草酸進行有效的定量。鑒于色譜分析方法特異性強、靈敏度高的優點，適用于甲殼類水產品草酸殘留量的檢測。已有報道的離子色譜法，其研究對象均為小龍蝦，缺少對其他甲殼類水產品草酸殘留的研究，且只對小龍蝦體表的草酸進行測定，沒有對樣品整體進行更深入的研究。
由于國內甲殼類水產品中草酸含量的測定無相關檢驗標準及判定標準，國內外對草酸分析方法的研究，主要集中在環境檢測及植物源性草酸測定，對甲殼類水產品中草酸含量的測定研究較少。而“洗蝦粉”導致的甲殼類水產品草酸超量引起中毒的現象，經媒體報道后，立即成為群眾關心的熱點問題。這些問題受到了監管部門的重視，目前，關于甲殼類水產品草酸含量的測定研究較少，監管部門缺乏標準及技術支持，對監管造成困難。因此，加強對甲殼類水產品中草酸含量的檢測技術研究，可有效保障人民生命財產的安全。
本文根據草酸水溶性強、在堿性條件下呈陰離子狀態穩定存在的特點，建立了一個基于陰離子交換色譜分離，洗脫液背景抑制，電導檢測的分析方法，測定甲殼類水產品中草酸的殘留量。該方法無需衍生，具有抗非離子物質干擾能力，靈敏度高，準確性好，能滿足甲殼類水產品的檢測需求，具有良好應用前景。
1材料與方法
1.1儀器與試劑
DionexICS-3000雙系統離子色譜儀，美國賽默飛世爾科技公司;EG淋洗液自動發生器、AS-AP自動進樣器、DP四元梯度泵、DC控制單元、Chromeleon7.0色譜工作站(變色龍工作站)，美國賽默飛世爾科技公司;KDC-1044低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司;Milli-Q超純水系統，美國Merk密理博公司;MS3basic漩渦混合器，德國艾卡公司;KQ-250DV數控超聲波清洗儀，昆山市舒美牌超聲儀器有限公司;BrandTransferpette移液槍(100~1000μL、0.5~5mL)，德國BRAND公司;固相萃取裝置，美國沃特世公司;5mL一次性注射器，湖南平安醫械科技有限公司;有機相針筒式濾膜過濾器(13mm×0.22μm)，天津市津騰實驗設備有限公司;DionexOnGuardⅡRP2.5mL過濾柱，美國賽默飛世爾科技公司;DionexOnGuardⅡAg/H2.5mL過濾柱，美國賽默飛世爾科技公司;50mL高速離心管，美國Corning公司;乙腈(色譜純)，德國Merck公司;草酸標準品(粉劑，純度97%)，德國Dr.Ehrenstorfer公司;超純水(18.2MΩ)，實驗室自制。
根據實際需求稱取適量草酸標準物質，用純水溶解配成草酸標準儲備液，放置于4℃冰箱保存，臨用前用超純水稀釋成所需濃度的工作液。
分析樣品：淡水小龍蝦、淡水河蟹、海水青蟹和海水明蝦樣品均購于本地不同市場。
1.2樣品的提取與凈化
提�。喝〖s50g甲殼類水產樣品，帶殼放入料理機粉碎機均質(蟹類錘碎后整體粉碎)，充分混勻。稱取均質后的試樣5.00g(精確至0.01g)置于50mL帶螺紋蓋的聚丙烯尖底離心管中，加入超純水10.0mL，渦旋振蕩3min，超聲提取30min，以4000r/min速率低溫冷凍離心3min，去除脂肪，移取所有提取液至10mL容量瓶中并用超純水定容。
活化：OnGuardIIRP柱用10mL甲醇、10mL超純水活化，OnGuardIIAg/H柱用10mL超純水活化，活化后的按照RP-Ag/H的順序進行串聯，柱后接上濾膜。
凈化：準確移取容量瓶中樣品提取液1.00mL至10mL容量瓶中，加入1.00mL乙腈渦旋1min，沉淀蛋白質及其他雜質。靜置分層后，再準確移取1.00mL樣品上清液至15mL帶螺紋蓋的聚丙烯尖底離心管中，加入4.00mL超純水，振蕩1min混勻后，經過串聯固相萃取柱進化。凈化時，先用3mL混合液潤洗柱子，棄去，收集后續濾液，供離子色譜分析。
加標樣品的制備：在50mL聚丙烯尖底離心管中，準確稱取5.00g(精確至0.01g)均質后的陰性甲殼類水產試樣并加入適量草酸標準溶液，4℃冰箱冷藏放置12h。
1.3儀器條件
DionexIonPacAS11-HC分析柱(250mm×4mm)及IonPacAG-11保護柱(50mm×4mm);DionexADRS-600(4mm)電解再生抑制器，抑制電流124mA，外加水模式;AS-AP自動進樣，定量環100μL，滿環進樣;柱溫箱溫度30℃;電導檢測，電導池溫度35℃;在線電解生成淋洗液，流速1.0mL/min，淋洗程序見表l。
1.4數據處理
樣品通過離子色譜分離電導測定，得到具有導電性化合物的離子色譜圖。使用Chromeleon7.0色譜工作站采集處理數據，使用色譜峰的保留時間定性，色譜峰面積定量。圖表采用MicrosoftExcel2016軟件進行繪制。
2結果與討論
2.1離子色譜柱的選擇及色譜條件的確立
為了提高目標離子的電導響應強度，進樣量需達到100μL，同時天然食品中高濃度的陰離子(如Cl-，SO42-等)會造成過載現象，因此，需要使用高柱容量(250mm×4mm)、氫氧根體系的陰離子色譜分析柱：AS11-HC、AS16-HC、AS18-HC、AS19-HC[12,13]。由于AS19-HC適用于檢測樣品中的鹵氧化合物，AS18-HC常用于無機陰離子的快速分離，AS16-HC主要用于分析樣品中的易極化陰離子，AS11-HC適用于分離復雜基質中的大量無機陰離子和有機酸陰離子，并具有改善一價羧酸的分離效果。
草酸易溶于水和堿性水溶液，不溶于有機溶劑，且在堿性水溶液中以二價草酸根陰離子狀態存在，適用于離子色譜體系分離檢測。根據離子交換色譜的特點，為了將痕量被測離子與基體中其它陰離子有效分離，本文選用高容量羥基選擇性陰離子交換色譜柱AS11-HC作為分離色譜柱，可在分離復雜基質中的有機、無機陰離子時，獲得最佳色譜分析速度和分離度。
草酸在KOH淋洗液中以草酸根形式存在，草酸根在陰離子交換柱(AS11-HC)上是強保留離子，難以洗脫，為了使草酸和其它陰離子能夠完全分離，采用KOH淋洗液梯度淋洗分離，梯度淋洗條件見表1。在上述色譜條件下，草酸出峰時間為11.7min(圖1)，峰形良好。
2.2提取條件的選擇
為了優化草酸的提取，實驗分別研究了超純水、50%乙腈水溶液、50%甲醇水溶液、1.00%甲酸水溶液、0.50%KOH水溶液對添加2.00mg/kg草酸的甲殼類水產加標樣品(小龍蝦、河蟹、青蟹、明蝦)提取效果，實驗結果見圖2。數據顯示，當使用50%乙腈水溶液和50%甲醇水溶液提取時，所有樣品草酸回收率均低于60%。甲殼類水產品中蛋白、脂肪含量較高，乙腈水溶液和甲醇水溶液均會將樣品中脂溶性物質提取到提取液中，且草酸易溶于水，不溶于有機溶劑，導致這兩種溶劑對草酸的提取效率不理想。由于甲殼類水產樣品基質較為復雜，在酸或堿溶液中會使樣品中部分物質轉變成離子狀態進入提取液中[14,15]，其特有的甲殼素類物質，在堿性條件下會水解產生氨基葡萄糖，對提取液中草酸的離子色譜出峰造成嚴重干擾，無法進行準確定量。而采用超純水提取，草酸回收率大于85%，且不會增加其他離子干擾，因此本文采用超純水作為提取溶劑。
此外，甲殼類水產品由于生長及蛻殼需要，一般生活在含有鈣，鎂，鐵等離子的養殖水中[16]，甲殼類水產品的飼料亦含有大量鈣元素[17]。本文測定10個銷售攤點養殖水的鈣含量，發現Ca2+含量均大于25.0mg/L。草酸鈣在25℃水中溶解度為：6.70mg/L，養殖水存在的草酸根，會與鈣離子形成不溶于水的草酸鈣晶體，無法進入甲殼類水產品體內。由于草酸鈣晶體不溶于水，當用超純水提取樣品時，草酸鹽不會對草酸檢測結果造成影響。
超純水提取甲殼類水產品時，水產樣品中的大量水溶性蛋白、氨基酸、糖類物質等會同時進入提取液中。根據離子交換特性及相關研究[18-22]，我們通過乙腈沉淀法去除蛋白質、糖類等雜質。提取液加入乙腈后，乙腈打破了原有提取液中的電解質平衡，在離子效應、共沉效應、電解質作用等共同作用下，蛋白質、氨基酸、糖類等凝結成大分子物質沉淀出來[23]，使樣品溶液更加清澈透明，提高了凈化效果。
2.3固相萃取條件的優化
樣品提取溶液經過乙腈沉淀去除雜質后，溶液中仍然存在低極性化合物與離子態干擾物，影響甲殼類水產品草酸殘留量的準確測定。因此，需要對初步除雜后的樣品提取液進行固相萃取凈化，以免干擾物質對草酸的峰形及草酸的定性、定量產生影響。本文分別研究了四種固相萃取柱的凈化效果，包括反相吸附的C18(6mL，500mg)固相萃取柱，親水-親脂平衡吸附OasisHLB(6mL，500mg)柱固相萃取柱，大孔樹脂填料的DionexOnGuardⅡRP(2.5mL)串聯Ag/H(2.5mL)固相萃取柱和富集凈化的弱陰離子交換柱(OasisWAX，6mL，500mg)的凈化效果，結果見圖3、圖4。從離子色譜圖上發現，C18柱固相萃取凈化后，草酸回收率較好，但是譜圖上仍然存在干擾峰。HLB柱可以去除甲殼類水產品提取液中的脂肪和極性物質，但是作為極性物質的草酸也會被吸附，回收率不理想。使用弱陰離子交換柱(OasisWAX)凈化富集時，由于甲殼類水產樣品中含有大量有機酸、脂肪酸、蝦青素、氨基酸和Cl等陰離子類雜質，與草酸產生相應的競爭吸附，因此目標化合物的回收率較低。
使用OnGuardⅡRP串聯Ag/H固相萃取柱凈化時，不同基質樣品回收率均達到70%以上。樣液先通過填料為大孔二乙烯基苯樹脂的OnGuardⅡRP柱去除甲殼類水產品基質中的親脂型疏水物質，且對親水性的草酸幾乎沒保留。然后通過填料為包含Ag+與H+的高容量強酸型聚苯乙烯型陽離子交換樹脂的OnGuardⅡAg/H柱去除提取液中的Cl及微量重金屬。最后，使用0.22μm的有機針式過濾膜進行過濾，不僅達到理想的凈化效果，還降低了提取液中固體懸浮顆粒對色譜系統的損害[24](見圖3、圖4)。
實驗數據顯示，RP串聯Ag/H固相萃取柱的除雜效果明顯，洗脫溶液較透明干凈，目標物回收率達到77%，凈化效果理想。綜上所述，選擇將甲殼類水產品提取液分別過經活化的OnGuardⅡRP柱和OnGuardⅡAg/H柱及有機相針式濾器的方式進行凈化。
2.4線性范圍與檢出限
在優化條件下，分析草酸質量濃度為0.050、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00mg/L的標準溶液，以草酸的質量濃度x(mg/L)對峰面積y建立標準工作曲線，得到草酸線性方程為y=0.4550x+0.0281，相關系數r2=0.9998。
以樣品進樣量100μL，將產生3倍于噪音水平的信號所代表的待測組分的最小濃度來計算檢出限，將產生10倍于噪音水平的信號所代表的待測組分的最小濃度來計算定量限。根據本文研究，草酸的檢出限分別為小龍蝦0.037mg/kg，河蟹0.038mg/kg，青蟹0.041mg/kg，明蝦0.033mg/kg;草酸的定量限分別為小龍蝦0.12mg/kg，河蟹0.13mg/kg，青蟹0.14mg/kg，明蝦0.11mg/kg。實驗數據表明，檢驗方法準確靈敏，符合檢測要求。
2.5方法回收率與精密度
為驗證方法的準確度，按本文方法對甲殼類水產樣品(小龍蝦、河蟹、青蟹、明蝦)和超純水進行了1.00、10.00、25.00mg/kg，3個水平的加標回收實驗(n=6);采用中間添加水平(10.0mg/kg)的樣品連續測定5d，考察方法的日間精密度，扣除相應本底值后，實驗結果見表2，甲殼類水產樣品基質中草酸的平均回收率為75.71%~88.85%，日內相對標準偏差(RSD，n=6)在1.74%~3.61%之間，日間精密度在2.11%~2.75%之間。超純水的平均回收率為96.35%~98.02%，日內相對標準偏差(RSD，n=6)在1.73%~2.02%之間，日間精密度為1.83%。方法顯示了良好的準確性和重現性，且在前處理過程對草酸含量的損失較低。
2.6實際樣品的測定
隨機購買市場上10個銷售攤點的樣品，采用本文方法對買回來的甲殼類水產樣品：小龍蝦、河蟹、青蟹、明蝦進行分析，結果顯示所有樣品均有檢出草酸，結果見表3，其中甲殼類海水產樣品含量較低，青蟹分布在5.97~32.02mg/kg之間;明蝦分布在4.05~28.01mg/kg之間。甲殼類淡水產樣品含量較高，小龍蝦分布在40.86~88.73mg/kg之間;河蟹分布在28.90~57.85mg/kg之間。圖5為其中一個陽性小龍蝦樣品的離子色譜圖，檢出草酸含量為45.66mg/kg。
2.7甲殼類水產品中草酸的來源分析
本文將部分小龍蝦、河蟹、青蟹、明蝦用超純水洗刷5次，浸泡超聲10min并更換超純水5次，然后按照2.2步驟進行制樣和處理，測定水洗前后甲殼類水產品草酸的含量變化，結果見表3。從表3的結果數據可見，用純水清洗后甲殼類水產品草酸殘留量明顯降低，這說明有一部分草酸殘留在甲殼類水產品的體表。
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為了進一步了解草酸在甲殼類水產樣品不同部位的殘留情況，本文將甲殼類水產樣品按照肌肉、內臟、外殼分別放入料理機粉碎機均質，充分混勻，按照優化后的提取凈化步驟進行前處理，檢測甲殼類水產樣品不同部位草酸的殘留量范圍，結果見表4。從表4的結果數據可知，在甲殼類水產樣品各個部位中，內臟草酸含量最高，外殼次之，肌肉最低。
根據相關文獻研究可知[25,26]，甲殼類水產樣品體內的草酸可分為外源性草酸和內源性草酸[27]，無論是外源性草酸還是內源性草酸，最終均會富集在其內臟中，所以其內臟的草酸殘留最高。王陽葆經過研究[28]發現，甲殼質對陰離子具有吸附作用，因此甲殼類水產樣品外殼的草酸殘留量高于其肌肉部分。商販使用“洗蝦粉”對甲殼類水產品進行清洗時，因其見效快，一般浸泡時間較短，草酸來不及進入甲殼類水產樣品體內，因此，認為來源于“洗蝦粉”的草酸主要附著在甲殼類水產品表面。此外，甲殼類水產品中體表殘留的草酸還有可能來自養殖土壤[29]、水體[30]、外部大氣環境中的污染物[31,32]等。本文購買樣品時已確認，所有樣品均未使用“洗蝦粉”進行清洗，根據表3實驗結果可知，甲殼類水產樣品體表來源于土壤、水體、大氣污染的草酸含量為5.20~8.65mg/kg。
3結論
3.1本文建立了一種快速提取、固相萃取凈化結合離子色譜測定的甲殼類水產品中草酸殘留量分析方法。樣品經超純水提取、乙腈沉淀雜質、固相萃取柱柱凈化，樣液中的草酸通過AS11-HC色譜柱分離，電導檢測器檢測。與已有離子色譜法相比，本文研究了更多類型甲殼類水產品的草酸殘留情況，并對樣品中草酸的來源進行了分析。檢測結果發現，本文購入的甲殼類水產品均檢出草酸殘留，結果在4.05~88.73mg/kg之間;水產品各個部位的草酸殘留情況為內臟>外殼>肌肉;經過分析認為樣品中草酸來源于消化系統的攝入富集和體外環境附著。
3.2本方法具有良好的凈化效果、準確的定性定量以及高效快捷的特點，適用于甲殼類水產品中草酸殘留的快速確認和含量分析。本方法的建立和使用為食品安全實施監督管理提供科學依據，相關實驗數據對政府部門監管“洗蝦粉”濫用及甲殼類水產品的食品質量安全具有重要意義。——論文作者：黃嘉樂*，黨華，吳滋靈，岑建斌，黃嘉瑜，陳偉萍
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